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TRAIL联合IL-2转染肾癌TIL的研究 目的:研究从人肾癌组织中分离的肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）,在体外培养扩增后用肿瘤坏死因子相关凋亡配体（Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand,TRAIL）联合白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）进行基因转染后能否增强TIL细胞的体外增殖能力和对自体肾癌细胞以及肾癌细胞系细胞（786-0）的体外杀伤活性。 方法:用RT-PCR技术由人总RNA中克隆出TRAIL和IL-2 cDNA,先将两个基因连接到克隆载体pMD18-T-simple,经PCR、限制性内切酶酶切确认酶切位点的有效性,测序确认基因序列的正确性。将两个分别和联合克隆到具有双启动子的真核表达载体pBudCE4.1。用分子生物学技术构建出pBudCE4.1-IL-2,pBudCE4.1-TRAIL,pBudCE4.1-TRAIL-IL-2三种重组质粒并予以鉴定。用现代细胞培养技术,从10例肾透明细胞癌分离出肾癌细胞和相应的TIL。分别在体外进行扩增和培养,初步测定单纯在体外培养的TIL对自体和细胞系肾癌细胞的杀伤效应。用脂质体介导的方法,将空载体pBudCE4.1和三种重组载体真核表达载体pBudCE4.1-IL-2,pBudCE4.1-TRAIL,pBudCE4.1-TRAIL-IL-2转染到TIL中,通过抗性标志筛选出抗Zeocin克隆,分别命名为TIL/IL-2,TIL/TRAIL,TIL/TRAIL+IL-2和TIL/vector,未转染TIL命名为TIL/Parental。应用Northern blot、Western blot分析转染前后以及转染不同载体后TRAIL和IL-2基因在TIL中的表达。应用ELISA分析方法测定各组TIL细胞IL-2的分泌量。将经过筛选、鉴定的TIL作为效应细胞（effector cell,EC）,自体肾癌细胞和人肾癌细胞株786-0细胞作为靶细胞（target cell,TC）,固定EC:TC比例为20:1,用51Cr释放实验测定TIL的细胞毒活性。用流式细胞仪测定靶细胞凋亡率。 结果:成功克隆TRAIL和IL-2基因,并成功克隆到克隆载体和真核表达载体上。成功分离并体外培养了10例肾透明细胞癌肿瘤细胞和TIL细胞。将重组载体和空载体分别转染TIL细胞并分离出抗性克隆。Northern blot、Western blot