冠状病毒(Coronavirus)在系统分类上属于冠状病毒科(Coronaviridae),冠状病毒属(Coronavirus)，因形态似日冕而得名。冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一,可引起儿童上呼吸道感染和婴儿、新生儿急性肠胃炎,严重者可引起急性呼吸综合征、器官衰竭乃至死亡。迄今为止,WHO共确认了六种能引起人类感染的冠状病毒亚型,即人冠状病毒229E型(Human Coronavirus229E, hCoV-229E)、人冠状病毒OC43型(hCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, SARS-CoV)、人冠状病毒NL63型(hCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1型(hCoV-HKU1)及中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV)。hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-NL63和hCoV-HKU1,致病性相对较弱,在人群中持续存在,分布于全世界各个地区,常于冬季和早春引起人呼吸道感染系列症状,包括高发病率的肺炎和支气管炎。SARS冠状病毒具有强的致病性和传染性,主要引起人类传染性非典型性肺炎,即严重急性呼吸综合征,爆发流行于2002年～2003年,波及了全球5大洲的30多个国家,感染了8000多人,造成900多人的死亡,仍是威胁人类健康的潜在病原体。2012年9月发现的一种新型冠状病毒,中东呼吸综合征冠状病毒,引起一种症状类似于非典,能导致急性肾衰竭的疾病,称之为中东呼吸综合征。截止至2014年2月7日,WHO共确认了182例感染病例,其中包括79名死亡病例,死亡率达43%。MERS-CoV是继SARS-CoV之后发现的另一种致病性强、死亡率高的冠状病毒。该病毒预示着新一轮威胁着人类健康的致死性冠状病毒感染发生的风险存在。因此,我们需监测其在人群中分布与感染情况,建立已知或未知冠状病毒的更为快捷、方便、准确的分子生物学、血清学等储备的检测方法,为未知冠状病毒的早期发现提供足够的理论依据。冠状病毒粒子呈球状,具有不规则形状,直径为60-220nm,外包着包膜,包膜表面的刺突呈放射状排列,人冠状病毒的突起为花瓣状,排列成一圈；病毒颗粒内部由RNA和核衣壳蛋白组成,呈螺旋式结构。病毒核酸为单股正链RNA病毒,全长27-33kb,不分节段,是已知RNA病毒中最长的RNA核酸链。冠状病毒主要的结构蛋白包括核衣壳蛋白(nucleocapsid, N)、跨膜蛋白或基质蛋白(membrane, M)、包膜小蛋白(Small membrane, E)和刺突蛋白或纤突糖蛋白(spike glycoprotein, S), β-B群冠状病毒如人冠状病毒OC43还有另一种具有凝血和乙酰酯酶活性的结构糖蛋白,血凝素-酯酶(haemagglutinin-esterase, HE)。SARS-CoV N蛋白是结构蛋白中第二大编码蛋白,也是最为丰富的结构蛋白之一,由第九个开放阅读框(Open reading frame, ORF)编码,含422个氨基酸残基,相对分子质量约为48kDa,理论等电点为10.1。N蛋白具有高度磷酸化和高亲水性,无半胱氨酸残基和二硫键,稳定性较其他结构蛋白差。它在宿主细胞质中合成后迅速产生磷酸化,与病毒RNA结合形成核衣壳,参与病毒的复制；其还可与M糖蛋白C端相互作用,参与病毒出芽成熟。N蛋白在传代过程中相对稳定,与其他冠状病毒N蛋白同源性仅有20-30%。前期的相关研究证实SARS-CoV N蛋白可诱导产生强烈的体液和细胞免疫,是主要的抗原分子、临床诊断的最佳靶标和预防疫苗的候选蛋白。自2003年以来,不少的国内外研究者在利用基因工程技术重组N蛋白的基础上建立SARS相关的血清学诊断方法。在此背景下,本实验前期工作采用了大肠杆菌表达系统表达了带GST标签的SARS-CoV的重组N蛋白,并建立了用于SARS-CoV感染早期诊断的N抗原捕获抗体夹心ELISA方法；同时本实验也在大肠杆菌表达系统中表达了带his标签的人冠状病毒229E和OC43的N蛋白。但是由于大肠杆菌表达系统本身存在的缺陷问题,这些重组的N蛋白在生物学功能与结构上与天然的N蛋白存在一定的差异。相关的研究显示,大肠杆菌来源的核衣壳蛋白的免疫原性较真核系统来源的差,且由于其缺乏磷酸化,与阴性血清标本存在一定程度的交叉反应。本研究在杆状病毒-昆虫系统中表达了SARS-CoV、hCoV-229E、hCoV-OC43的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, NP),并分析SARS-NP的抗原反应性：此外,为了调查人群中流行的已知和未知的新型冠状病毒的种类及其遗传信息,我们建立了一种针对广谱冠状病毒的冠状病毒通用型巢氏PCR临床检测方法,并将该方法应用于临床呼吸道标本的冠状病毒核酸检测进行方法性能评估。研究的主要内容分为如下两部分：1.人冠状病毒(SARS-CoV、229E、OC43)核衣壳蛋白在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达(1) SARS-CoV核衣壳蛋白(SARS-NP)在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达及抗原特异性分析用含BamH1和SalI限制性内切酶酶切位点的引物序列,以pGEX-5X-3/N质粒为模板,扩增SARS-NP全长基因。该基因片段全长为1269bp。纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接,经蓝白斑筛选和TA克隆测序验证；用BamHI和Sal I两限制性内切酶双酶切目的基因片段与Bac-to-Bac系统的pFastBacHTC载体后,目的基因片段定向插入pFastBacHTC载体,转化DH5a感受态细胞,经PCR扩增、双酶切鉴定及测序验证,测序正确的阳性克隆即为构建成功的重组质粒pFastBacHTC-SARS-NP.正确的重组质粒经转化DH1OBacTM感受态细胞,于含抗生素的LB平板筛选和PCR扩增鉴定后所得的阳性单克隆质粒即为构建成功的SARS-NP重组杆粒DNA。将重组杆粒DNA转染Sf9细胞,获得的杆状病毒液加入High Five细胞中,在细胞数为2×106cells/mL、MOI达到5、表达时间为72h的条件下表达SARS-NP;所获得的蛋白溶液经Ni-NTA亲和树脂纯化后,使用本实验前期建立的双抗体夹心ELISA方法鉴定,并用原核表达的SARS-NP兔免疫血清、SARS患者恢复期血清,分别针对hCoV-229E和hCoV-OC43的杂交瘤培养上清、兔免疫血清、患者恢复期血清以及正常人血清的免疫印迹实验分析其抗原特异性及与hCoV-229E、 hCoV-OC43的抗原相关性。本研究成功的构建pFastBac HTC-SARS-NP重组质粒。蛋白溶液经Ni-NTA亲和树脂纯化后,可获得表达量为0.2mg/mL、相对分子量约为48kDa的SARS-NP可溶性蛋白,同时存在一部分约为35kDa的疑似降解物的蛋白。SARS-NP经双抗体夹心ELISA方法和与抗SARS-NP单克隆抗体的免疫印迹验证为目的蛋白。该蛋白通过免疫印迹实验分别与原核表达的SARS-NP兔免疫血清和13份SARS患者恢复期血清反应,而与针对hCoV-229E和hCoV-OC43的杂交瘤培养上清、兔免疫血清、患者恢复期血清(hCoV-229E患者血清3份,hCoV-OC43患者血清6份)及6份正常人血清均无交叉反应,说明所获得的SARS-NP具有良好的抗原特异性,且与hCoV-229E和hCoV-OC43无交叉反应。(2)人冠状病毒229E核衣壳蛋白(229E-NP)和人冠状病毒OC43核衣壳蛋白(OC43-NP)在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达用含BamH I和Not Ⅰ限制性内切酶酶切位点的引物序列,以pQE30/hCoV-229E-N和PQE30/hCoV-OC43-N质粒为模板,分别扩增229E-NP和OC43-NP的全长基因。这两基因片段全长分别为1170bp、1347bp。在pFastBac HTC-SARS-NP质粒和杆粒DNA构建的条件下分别构建pFastBac HTC-229E-NP质粒、pFastBac HTC-OC43-NP质粒以及相应的杆粒DNA在SARS-NP的表达和纯化条件下表达并纯化229E-NP和OC43-NP。用分别针对hCoV-229E和抗hCoV-OC43的杂交瘤上清、免疫兔血清的免疫印迹实验验证重组的229E-NP和OC43-NP的蛋白溶液。本研究成功的构建了pFastBac HTC-229E-NP和pFastBac HTC-OC43-NP重组质粒。在SARS-NP的表达条件下,本实验获得了相对分子质量在40-55kDa之间的可溶性蛋白229E-NP和相对分子质量在55-70kDa之间的可溶性蛋白OC43-NP,两者经Ni-NTA亲和树脂纯化的效果不理想。重组的229E-NP和OC43-NP的免疫印迹实验中,可分别与其相对应的杂交瘤培养上清和兔免疫血清反应,说明所获得的这两种重组蛋白均为具有抗原特异性的目的蛋白。2.冠状病毒通用型巢氏PCR临床检测方法的建立与初步临床评价使用由武汉病毒所提供的以冠状病毒RNA依赖RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase gene, RdRp基因)为靶基因的引物建立一种检测广谱性冠状病毒的巢氏PCR临床检测方法；经PCR产物TA克隆后测序的方式鉴定巢氏PCR阳性结果的具体冠状病毒亚型；用甲型流感病毒(IVA)及其亚型(H1N1-09、H3N2)、乙型流感病毒(IVB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、副流感病毒4型(PIV4)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RhV)、腺病毒(ADV)共11种非冠状病毒的呼吸道病毒评估该方法学的特异性；用人冠状病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43、 hCoV-NL63、hCoV-HKU1)的RdRp基因的T载体质粒作为模板,按10倍的倍比稀释的方式评估该方法的最低检测限(Limit of detection, LOD)：收集384份2013年珠江医院门急诊及住院发热呼吸道症候群患者的呼吸道标本对该方法进行初步临床评估,并与呼吸道病毒实时荧光RT-PCR方法比较,分析其相关的诊断性能。本研究所建立的冠状病毒通用型巢氏PCR临床检测方法对四种人冠状病毒(hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-NL63和hCoV-HKU1)的检测下限分别为5.84×103copies/μL、8.36×103copies/μL、6.06×103copies/μL和6.18×102copies/μL，对其它非冠状呼吸道病毒如IVA及其亚型(H1N1-09、H3N2)、 IVB、PIV1、PIV2、PIV3、PIV4、RSV、RhV、ADV等检测均为阴性。用经实时荧光RT-PCR方法鉴定的384份临床呼吸道标本对建立巢氏PCR联合测序分型方法检测临床标本的性能进行了评价。384份呼吸道标本经实时荧光RT-PCR方法检测,四种人冠状病毒的总阳性率为4.95%(19/384),其中hCoV-229E阳性率为2.34%(9/384)、hCoV-OC43阳性率为1.82%(7/384)、hCoV-NL63阳性率为0(0/384)和hCoV-HKU1阳性率为0.78%(3/384)。巢氏PCR联合测序分型方法检出的人冠状病毒总阳性率为3.65%(14/384),其中hCoV-229E阳性率为1.56%(6/384)、hCoV-OC43阳性率为1.82%(7/384)、hCoV-HKU1阳性率为0.26%(1/384),未检出其它冠状病毒。经统计学分析,两种方法对总冠状病毒、hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-HKU1检出率无统计学差异。以呼吸道病毒实时荧光RT-PCR为参照,巢氏PCR联合测序分型对总冠状病毒、hCoV-229E、hCoV-OC43、hCoV-HKU1的诊断灵敏度分别为73.7%、66.7%、100%和33.3%；其对总冠状病毒、hCoV-229E、hCoV-OC43以及hCoV-HKU1的诊断特异性和阳性预期值均为100%,提示该方法能基本满足临床检测需求。小结总结以上两部分的研究工作,本研究主要获得的成果如下：1.本研究成功的在杆状病毒-昆虫系统(Bac-to-Bac系统)表达了具有良好抗原特异性的SARS-NP,229E-NP和OC43-NP,并对SARS-NP的抗原性进行了初步分析,发现其与hCoV-229和hCoV-OC43无交叉反应。不足之处是本实验没能获得较纯的229E-NP和OC43-NP可溶性蛋白。2.本研究成功建立了冠状病毒通用型巢氏PCR临床检测方法,其检测结果与实验室自制的实时荧光RT-PCR方法比较,无统计学差异,灵敏度和特异性满足临床标本的检测需求。但因hCoV-NL63无阳性临床标本,未能评估巢氏PCR对hCoV-NL63的检出能力。因此,后期,我们将研究的关注点集中在获得较纯的229E-NP和OC43-NP的可溶性蛋白,并分别建立针对SARS-NP、229E-NP和OC43-NP的双抗原夹心ELISA方法；另外,对冠状病毒通用型巢氏PCR临床检测方法进行更深入的临床效能评估,以期能及时发现和监测其它型或新型的冠状病毒感染,弥补目前建立的荧光定量RT-PCR方法学的不足。