Hepatitis C VirusHCV病毒是一种单链RNA病毒,目前除干扰素和利巴韦林的联合用药外,尚无有效的治疗手段.HCV NS3解旋酶解开病毒复制过程中形成的RNA双链结构让复制过程得以继续,是病毒复制周期中的关键酶.为了加速寻找抗HCV药物的过程,我们以HCV NS3解旋酶为靶点,进行了计算机模拟筛选的探索.计算机模拟筛选是以计算机的方法模拟受体或靶点结构,对一定的数据源(样品库)进行亲和力评价,能够大大加速药物发现的一种方法.我们使用被学术界承认的Accelrys公司的Insight Ⅱ 和Cerius 2 软件平台和SGI工作站,通过对HCVNS3解旋酶进行蛋白建模,优化,已知抑制剂分子对接验证等过程,以微生物天然产物数据库(MNPD)为数据源对NS3解旋酶蛋白模型进行了刚性筛选和柔性评价,从2000个样品中筛得5个打分较高的化合物.本工作得到了创腾科技(Neotrident Inc.)的大力帮助.为了进一步对计算机模拟筛选的结果进行生物活性验证,我们设计了一种基于荧光能量转移(FRET)现象的,适用于高通量筛选(High Through-put Screen,HTS)的NS3解旋酶活性的荧光检测法.在本实验中,我们用麦芽糖亲和层析介质进行纯化了从重组的pMAL-c2载体中表达的NS3-4A蛋白.我们设计了NS3解旋酶的FRET底物,它是由两条3-和5-端标各记荧光供体(HEX)和荧光受体(TAMRA)的互补单链DNA形成的双链DNA结构.在形成DNA双链的同时,链末端相互靠近的HEX和TAMRA之间会发生FRET现象,当解旋酶解开双链底物后,FRET现象消失.可以借此对酶活性进行同质和即时的监测.我们采取各种条件对反应体系进行了摸索,使用已知NS3解旋酶抑制剂阿霉素对模型进行了验证,并初步筛选了一批化合物.结果证明本实验设计的HCV NS3解旋酶FRET荧光检测法具有不需要洗板,灵敏快速等特点,为结合计算机模拟筛选结果的生物活性验证打下了必要的基础.