纤维素降解的筛选鉴定及降解能力评价

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本研究对前期采集的23份土壤样本及3份腐木样本进行微生物富集培养,共分离筛选出16株微生物纯培养物,以微晶纤维素为单一碳源对其进行筛选,获得两株纤维素降解真菌,分别将其命名为C006及C008菌株。两者菌落形态相近,通过形态学研究初步判定两者均属于木霉属,其中C006菌株经ITS分子生物学鉴定后被确定为深绿木霉Trichoderma atroviride,这是首次发现深绿木霉对微晶纤维素具有降解作用。通过对其进行微晶纤维素降解特性研究发现,两菌株CM培养基刚果红染色呈无色透明状,说明两者对微晶纤维素均有较好的降解活力;将微晶纤维素作为单一碳源对两菌株进行液体培养,7天后浑浊的培养基变澄清,培养基中的微晶纤维素物质基本被完全利用。此外,C006菌株在液体培养过程中还伴随着pH明显下降现象,培养液的pH值在7天内可由最初的7.4降为最低的2.5,最终稳定在3.0附近,说明C006菌株在降解微晶纤维素过程中产生了大量稳定的酸性物质,且该菌株具有较强的耐酸特性,这也是首次发现微晶纤维素在进行生物转化过程中产生酸物质。通过3,5-二硝基水杨酸法对C006及C008菌株进行了羧甲基纤维素钠(CMC)降解活力测定,结果发现两者酶活特性基本一致,在pH值4.0时纤维束酶活性最高,两种菌株产生的纤维素酶均具有嗜酸特性。C006及C008菌株纤维酶活的最适温度均为55℃;经60℃以上的高温处理30min以后,残余酶活剩下不到40%;金属离子对CMC酶活的影响较为显著,其中,Mn2+和Fe2+可使纤维素酶活性提高1倍左右,对酶蛋白有显著的促进作用,而Hg+和Cu2+等重金属离子可使酶活降低90%以上,对酶蛋白有强烈的抑制作用。高效液相色谱法对C006菌株的纤维素发酵液中的酸性降解产物进行分析,结果表明,通过生物降解,发酵液中产生了丙二酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸及丙烯酸等简单脂肪酸,同时还产生了9种未知的主要降解成分;气质联用法对酸性发酵液进行分析,结果仅发现部分苯酚类及酮类等结构复杂次生代谢产物,结合气相色谱图及发酵液乙酯化反应,推测微晶纤维素经C006菌株降解后产生的酸性物质主要为结构较稳定并难以降解的酸性生物大分子。
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