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研究背景:乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率和致死人数居首位,严重威胁着女性生命健康,尤其是占乳腺癌总数约10%~20%的三阴性乳腺癌,由于恶性程度高且缺乏有效地治疗方法,预后极差。如何能够早期诊断,并准确分型和针对性靶向治疗成为目前攻克乳腺癌的关键,也是解决所有癌症问题的共通出路。肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤协同作用的过程,癌基因的激活、抑癌基因的失活在这过程中有重要意义。P53、PTEN和c-Myc是与乳腺癌发生和进展密切关联的癌基因与抑癌基因,尤其是在三阴乳腺癌中,P53突变频率极高,约80%的三阴性乳腺癌存在P53的突变,生物学行为更为恶劣,治疗更为棘手。然而,对于P53在乳腺癌外周血中的表达情况不太清楚。相对于肿瘤组织,外周血白细胞是极易获得的标本,且有研究证实肿瘤患者外周血中基因的表达明显异于健康人群。因此,本课题首先检测P53、PTEN、c-Myc的m RNA在乳腺癌患者外周血白细胞中的表达水平,探讨其与临床病理资料间的相互关系及其潜在的临床应用价值,以期为乳腺癌的早期、无创检查探索潜在的有效途径。微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)是一种长约22个核苷酸的非编码RNAs,通过结合目的基因的m RNA,阻止翻译或降解m RNA,对目的基因进行转录后负性调控。研究证实miRNAs在肿瘤的发生和进展过程中发挥重要的调控作用,扮演着癌基因和抑癌基因的角色,探讨miRNAs在肿瘤中发挥的作用及其作用机制对于探索潜在的肿瘤标志物和治疗靶点都有重要的价值。最近的研究显示miR-449a在表达突变型P53蛋白的以及基底样型的乳腺癌组织中明显降低,而基底样型乳腺癌绝大部分是恶性程度最高的三阴性乳腺癌,且约80%的三阴性乳腺癌存在P53的突变。在肺癌、肝癌、前列腺癌等多种癌症中的研究显示miR-449a抑制癌细胞侵袭迁移和增殖,发挥抑癌作用。然而,miR-449a在三阴乳腺癌中作用如何,其与突变型P53之间是否具有潜在的相互调节作用,机制如何,能否为三阴乳腺癌的诊治提供新的思路?目前尚未见报道。因此,本课题第二部分探讨了miR-449a在三阴乳腺癌中所起的作用,及其及其突变型P53间的调控机制,旨在探索寻求潜在的生物标志物和治疗新靶点。目的:1.探讨肿瘤相关基因P53、PTEN、c-Myc在乳腺癌外周血白细胞中的表达情况与临床病理资料间的相互关系及其潜在的临床应用价值;2.明确miR-449a对三阴性乳腺癌细胞中突变型P53的调控作用,并初步探讨其作用机制。方法:1.Real-time PCR检测乳腺癌患者P53、PTEN、c-Myc基因的在乳腺癌、良性乳腺疾病女性患者和健康体检对照女性外周血白细胞中的m RNA表达水平;2.MDA-MB-468细胞转染P53敲低质粒p Super-Retro-puro-sh-P53(以下简称为sh-P53)和空载体质粒p Super-Retro-puro-Vector(以下简称为Vector),Real-time PCR检测P53、E-cadherin、Vimentin、Twist、Snail的m RNA和miR-449a水平,Western Blot检测P53、AKT1、p-AKT、p-m TOR、Bcl-2、caspase-3、Cleaved-caspase-3的蛋白水平;3.MDA-MB-468细胞转染miR-449a-mimic和miR-449a-NC,转染48h后Real-time PCR检测P53、E-cadherin、Vimentin、Twist、Snail的m RNA和miR-449a水平,转染72后Western Blot检测P53、AKT1、p-AKT、p-m TOR、Bcl-2.、caspase-3、Cleaved-caspase-3的蛋白水平;4.结晶紫染色法绘制生长曲线检测转染处理后MDA-MB-468细胞的增殖能力;5.划痕试验和Transwell实验检测转染处理后MDA-MB-468细胞的迁移能力。结果:1.乳腺癌和良性乳腺疾病患者外周血白细胞中P53和PTEN的m RNA表达水平明显降低;2.PTEN的m RNA水平下调与乳腺癌淋巴结转移及其病理分期密切关联;3.MDA-MB-468细胞中降低P53表达不影响miR-449a表达水平;4.降低P53表达明显抑制MDA-MB-468细胞增殖能力和迁移能力;5.敲低MDA-MB-468中突变型P53后,细胞信号通路PI3K/AKT/m TOR和EMT被抑制,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平下调,激活了凋亡执行蛋白caspase-3;6.升高MDA-MB-468细胞内miR-449a水平抑制了细胞增殖和迁移能力;7.升高miR-449a水平下调了MDA-MB-468细胞内突变型P53水平,同时抑制了PI3K/AKT/m TOR和EMT,下调了Bcl-2水平。结论:1.乳腺癌患者外周血白细胞中P53等肿瘤相关基因的m RNA表达水平与健康人群和良性乳腺疾病患者相比存在差异,且与临床病理资料高度相关,提示乳腺癌外周血白细胞中P53等肿瘤相关基因检测可为监测肿瘤发生、进展和预后判断提供极具潜力的无创检测手段;2.降低突变型P53的水平可抑制三阴乳腺癌MDA-MB-468的细胞增殖和迁移能力,降低其恶性程度,但不影响miR-449a的表达;3.降低突变型P53的水平可抑制PI3K/AKT/m TOR细胞信号转导通路和EMT,诱导细胞凋亡;4.miR-449a可通过下调突变型P53的表达水平,抑制PI3K/AKT/m TOR细胞信号转导通路和EMT,诱导细胞凋亡,从而抑制MDA-MB-468细胞的细胞增殖和迁移能力;5.miR-449a通过抑制突变型P53及其相关细胞信号通路,在三阴乳腺癌MDA-MB-468中起到抑癌基因的作用。