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第一部分Stathmin siRNA表达载体的构建与干扰效果的鉴定背景与目的：RNAi是转录后基因沉默，其作为一种高效的基因敲除工具，能有效调节有机体和细胞特定基因的表达，其为人类肿瘤的基因治疗提供了广阔的临床应用前景。构建stathmin基因RNA干扰真核表达质粒载体，并观察其转染C3h鼠源性骨肉瘤LM8细胞系前后stathmin基因表达的变化。方法：根据GenBank中stathmin（小鼠）序列，设计针对stathmin基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的干扰质粒载体pGenesil-1中，对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将3个重组质粒（pGenesil-1-stathmin1、pGenesil-1-stathmin2和pGenesil-1-HK）分别转染C3h鼠源性骨肉瘤LM8细胞系。细胞转染后G418筛选获得稳定的细胞系。研究的细胞分5组：C1组LM8细胞空白对照（命名LM8空白）；C2组LM8细胞+脂质体（命名LM8脂质体）；C3组转染非特异性的siRNA HK质粒（命名pGenesil-1-HK）；C4转染特异性的siRNA stathmin1质粒（命名pGenesil-1-stathmin1）；C5组转染特异性的siRNA stathmin2质粒（命名pGenesil-1-stathmin2）。然后实时荧光定量PCR检测各组LM8细胞系stathmin mRNA的表达，Western blotting技术检测stathmin基因在蛋白水平的表达。结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中成功插入了目的基因片断。pGenesil-1-stathmin1和pGenesil-1-stathmin 2转染C3h鼠源性骨肉瘤LM8细胞系后，均明显抑制了stathminmRNA及其蛋白的表达。结论：成功构建了针对stathmin RNA干扰质粒表达载体pGenesil-1-stathmin1和pGenesil-1-stathmin2，它们均能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8细胞系的表达。这为stathmin基因应用于骨肉瘤的治疗研究奠定了理论基础。第二部分Stathmin siRNA表达载体对LM8细胞生物学行为的影响背景与目的：Stathmin在多种恶性肿瘤细胞中都有高水平表达，通过抑制其表达可以明显干扰恶性肿瘤细胞的分裂，影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。本研究观察已构建的靶向stathmin基因RNA干扰质粒表达载体转染LM8细胞系后对细胞生物学行为的影响。方法：将已构建的靶向stathmin干扰质粒pGenesil-1-stathmin和通用对照质粒pGenesil-1-HK，以脂质体法将2个重组质粒分别转染骨肉瘤LM8细胞系。台盼蓝染色法测定观察细胞的生长，MTT（噻唑蓝）法比色分析检测细胞体外生长抑制率；软琼脂集落形成实验观察单个细胞体外增殖活力；细胞HE染色观察细胞形态学的变化；Hoechst染色观察细胞凋亡特征并计算凋亡率；流式细胞术定量分析细胞周期的变化；C3H小鼠移植瘤实验显示肿瘤细胞的成瘤能力。结果：成功构建的pGenesil-1-stathmin重组质粒转染LM8细胞后，明显抑制了细胞的体外生长，细胞体外生长抑制率显著增加；单个细胞体外增殖活力显著下降；细胞HE染色部分细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变；Hoechst染色显示细胞凋亡特征，细胞凋亡率明显增高；流式细胞术检测显示细胞周期阻滞于G2M期，比率明显增高；C3H小鼠移植瘤实验显示特异转染组肿瘤细胞致瘤率下降，肿瘤生长减缓。结论：成功构建的靶向干扰质粒pGenesil-1-stathmin能明显影响骨肉瘤LM8细胞的相关生物学行为。其有效抑制骨肉瘤细胞的增殖与生长，这为把stathmin基因应用于骨肉瘤的基因治疗研究奠定了理论基础。第三部分Stathmin基因沉默协同增效泰索帝对骨肉瘤细胞的化疗作用的实验研究背景与目的：Stathmin蛋白是至关重要的细胞周期调控因子，其促进微管解聚，阻断细胞有丝分裂纺锤体形成从而调节细胞的增殖。泰索帝抗肿瘤化疗药是通过促进微管聚合，从而导致纺锤体功能障碍及细胞的凋亡。本研究探讨stathmin基因沉默协同增效泰索帝对骨肉瘤细胞的化疗敏感性。方法：将已构建成功的针对stathmin mRNA的siRNA真核质粒转染LM8骨肉瘤细胞并获得稳定的细胞系。泰索帝和顺铂分别诱导对照组LM8细胞、转染的LM8细胞，台盼蓝染色法测定以上二组细胞的生长，软琼脂集落形成实验观察二组细胞的单个细胞体外增殖活力，MTT（噻唑蓝）法分别检测泰索帝和顺铂对二组细胞的半数抑制浓度，流式细胞术定量分析泰索帝对二组细胞周期及细胞凋亡率的影响。结果：与对照组相比，不同浓度的泰索帝和顺铂均抑制了LM8细胞的生长，但泰索帝对转染的LM8细胞生长抑制作用尤为明显；泰索帝较顺铂更加明显减少了单个细胞，特别是转染LM8骨肉瘤细胞体外增殖活力；泰索帝和顺铂对转染的LM8细胞半数抑制浓度均较对照组下降，但泰索帝半数抑制浓度下降程度更显著；流式细胞术检测显示泰索帝更易使转染LM8细胞阻滞于G2／M期，更易诱导转染LM8细胞的凋亡。结论：Stathmin基因沉默能明显增加泰索帝对骨肉瘤LM8细胞的化疗敏感性并协同诱导细胞凋亡，这为肿瘤的治疗提供了一个新思路。