研究背景与研究目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经系统进行性变性疾病,是老年期痴呆最常见的原因。其主要的病理特点是p淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑、Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结和神经元缺失。迄今对阿尔茨海默病尚无特异性的治疗方法。神经炎症机制在AD的发生发展过程中起着至关重要的作用,激活的小胶质细胞、星形胶质细胞、外周的淋巴细胞及炎症因子都在其炎症反应过程中扮演着重要的角色,神经炎症已经成为治疗AD的重要靶点。干细胞移植能通过抗炎及免疫调节作用来发挥神经保护作用。调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是一类具有免疫抑制性和无免疫源性的T细胞亚群,CD4+CD25+Tregs是Tregs亚群中的主要组成成分,具有天然的免疫抑制作用,可抑制CD4+或CD8+T细胞的活化、增殖,并能抑制小胶质细胞引发的神经炎症而起到神经保护作用。有证据表明,调节性T细胞的细胞数目和／或功能异常与AD的炎症或发病相关联。沃顿胶间充质干细胞(Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells,WJ-MSCs)是来源于人体脐带沃顿胶组织中的多能干细胞,除了具备干细胞的多系分化潜能之外,还具有特殊的免疫调节能力。那么WJ-MSCs对AD动物模型是否有神经保护作用呢?是否能够通过抗炎及免疫调节作用来发挥保护作用呢?WJ-MSCs是否可以在体外调节调节性T细胞的比例和／或功能呢?与WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植是否可以治疗AD呢?是否能抑制小胶质细胞引发的神经炎症呢?依据上述背景,本研究以APP/PS1双转基因小鼠为模型,研究尾静脉注射WJ-MSCs对AD的保护作用及其作用机制；WJ-MSCs与脾淋巴细胞体外共培养3天,研究WJ-MSCs是否可以在体外调节调节性T细胞的比例和／或功能；利用WJ-MSCs与自体小鼠脾淋巴细胞共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞心内注射移植至APP/PS1双转基因小鼠,研究其对APP/PS1小鼠的作用及其作用机制。研究内容1.研究WJ-MSCs对AD动物模型的作用及其作用机制；2.研究WJ-MSCs是否可以在体外调节调节性T细胞的比例和／或功能；3.研究与WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植对AD动物模型的作用及其作用机制。研究方法1.为明确WJ-MSCs对AD动物模型的作用及其作用机制,取足月剖宫产胎儿的脐带组织,分离得到WJ-MSCs后传代扩增。用6月龄的APP/PS1双转基因小鼠为模型,分为对照组和WJ-MSCs治疗组。WJ-MSCs组给予2×106/200u1个WJ-MSCs尾静脉注射,对照组给予200ulPBS尾静脉注射。3周后利用Morris水迷宫进行小鼠的行为学测试,观察并记录小鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)检测小鼠的学习能力,进行空间探索实验检测小鼠的记忆能力。治疗后4周采用硫磺素S染色法,检测小鼠脑冰冻切片老年斑的沉积,并采用Elisa法定量检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42水平。在治疗后的第1天和4周采用ELISA法检测血清和脑内抗炎因子IL-10含量；采用免疫组织化学染色检测小胶质细胞标志物Ibal的含量；实时定量PCR检测小鼠脑中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平,并采用ELISA法检测小鼠脑中IL-1β、TNF-α的蛋白含量。2.为明确WJ-MSCs是否可以在体外调节调节性T细胞的比例和／或功能,取足月剖宫产胎儿的脐带组织,分离得到WJ-MSCs后传代扩增。从6月龄的APP/PS1双转基因小鼠的脾脏分离脾淋巴细胞,WJ-MSCs与密度为5×105／孔/ml的脾淋巴细胞按1：5的比例(WJ-MSCs:脾淋巴细胞)在体外12孔板中共培养3天,或无WJ-MSCs的脾脏淋巴细胞培养3天,用流式细胞仪测定Tregs的比例。为明确与WJ-MSCs共培养后Tregs是否具有免疫抑制功能,我们把纯化的共培养后和未共培养的CD4+ CD25+调节性T细胞分别与CFSE标记的同种异体脾淋巴细胞在含有PHA(10ug/ml)培养基中体外共培养3天,用流式细胞仪和ModFit软件分析细胞增殖指数。3.为明确与WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植对AD动物模型的作用及其作用机制,从与WJ-MSCs共培养后的小鼠脾淋巴细胞纯化的CD4+CD25+调节性T细胞通过心内注射至APP/PS1双转基因小鼠(n=15),首次剂量为0.5×106个细胞/100ulPBS。然后一周后以0.2×106个细胞/100ulPBS剂量进行第二次注射。另一组APP/PS1双转基因小鼠(n=15)注射相同剂量PBS作为对照组。第一次注射3周后,注射CD4+CD25+调节性T细胞组(n=15)、PBS组(n=15)的APP/PS1双转基因小鼠利用Morris水迷宫试验进行行为学测试：观察并记录小鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)检测小鼠的学习能力,进行空间探索实验检测小鼠的记忆能力。在Morris水迷宫试验后,用ELISA法检测血清促炎细胞因子IFN-γ和抗炎细胞因子(IL-10和TGF-β1)的水平。第一次注射4周后,采用硫磺素S染色法,检测小鼠脑冰冻切片老年斑的沉积,并采用Elisa法定量检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42水平；使用Iba-1抗体标记小胶质细胞并通过荧光免疫组织化学方法分析APP/PS1双转基因小鼠脑内小胶质细胞的状态。研究结果1.WJ-MSCs对AD动物模型的神经保护作用及其作用机制1.1 WJ-MSCs改善了APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力,水迷宫试验结果显示,与PBS对照组相比,WJ-MSCs治疗明显缩短小鼠逃避潜伏期,在空间探索实验中,WJ-MSCs治疗组小鼠穿越平台次数和待在平台所在象限的时间均明显增加。两组小鼠之间的游泳速度没有显著区别。这说明尾静脉注射WJ-MSCs能够改善APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力。1.2 WJ-MSCs明显降低了APP/PS1双转基因小鼠脑内老年斑的沉积和可溶性Ap的水平。治疗后4周采用硫磺素S染色法,检测小鼠脑内的老年斑的沉积,结果显示,与PBS对照组比较,WJ-MSCs治疗显著降低了APP/PS1双转基因小鼠皮层和海马中老年斑的沉积。采用Elisa法定量检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42水平,结果显示,WJ-MSCs治疗能显著降低APP/PS1双转基因小鼠脑内可溶性Aβ40和Aβ42的含量。以上结果表明WJ-MSCs显著降低了APP/PS1双转基因小鼠脑内的Ap水平。1.3 WJ-MSCs对APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用的机制研究1.3.1 WJ-MSCs增加了APP/PS1双转基因小鼠血清及脑内抗炎因子IL-10的表达,抑制了炎症反应。干预后第1天,与PBS组比较,WJ-MSCs治疗组IL-10水平在血清和脑组织都显著增加,干预后4周,血清IL-10的表达在两组之间没有差别,然而,干预后4周,WJ-MSCs治疗显著地增加脑内的IL-10表达。1.3.2 WJ-MSCs抑制促炎性小胶质细胞激活,采用免疫组织化学染色检测小胶质细胞标志物Iba-1的含量,结果显示,尾静脉注射WJ-MSCs第1天后,小鼠Iba-1阳性小胶质细胞数量较PBS对照组增加,干预后4周,WJ-MSCs干预组Iba-1阳性小胶质细胞数量较对照组减少。提示WJ-MSCs可能在治疗后期抑制了促炎性小胶质细胞激活。1.3.3 WJ-MSCs显著降低了APP/PS1双转基因小鼠脑内促炎因子TNF-a和IL-1β的含量,但没有改变IL-6的含量。采用实时定量PCR检测AD小鼠脑中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。在治疗后第1天和4周,与PBS对照组比较,实时定量PCR检测显示AD小鼠脑中促炎因子IL-1p和TNF-α的mRNA水平在WJ-MSCs治疗组均显著降低,然而,两组之间的小鼠脑中IL-6的表达无明显改变。ELISA检测的数据显示,与PBS对照组相比,小鼠脑内IL-1β、TNF-α蛋白的含量在WJ-MSCs治疗组也显著降低。2. WJ-MSCs提高APP/PS1双转基因小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例和功能2.1 WJ-MSCs提高APP/PS1双转基因小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例。WJ-MSCs与脾淋巴细胞在1：5的比例(WJ-MSCs:脾淋巴细胞)体外共培养3天,流式细胞仪检测数据显示,与无WJ-MSCs共培养的脾淋巴细胞相比,CD4+CD25+调节性T细胞在T淋巴细胞亚群中的比例显著增加。2.2 WJ-MSCs增强APP/PS1双转基因小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制功能。把纯化的共培养后和未共培养的CD4+CD25+调节性T细胞分别与CFSE标记的同种异体脾淋巴细胞在含有PHA (10ug/ml)培养基中体外共培养3天,用流式细胞仪和ModFit软件分析细胞增殖指数,经过统计分析,结果显示,与未经共培养的CD4+CD25+调节性T细胞比较,WJ-MSCs共培养后纯化的调节性T细胞显著降低了PHA诱导的淋巴细胞增殖,提示WJ-MSCs不仅可以提高CD4+CD25+调节性T细胞的比例,而且可以增强CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制功能。3. WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植对AD动物模型的神经保护作用及其作用机制3.1 WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植改善了APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力。Morris水迷宫试验数据显示,WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植显著缩短了小鼠的逃避潜伏期并缩短了找到隐藏平台的路线距离。在空间探索实验中,治疗组穿越平台的次数和待在平台所在象限的时间均明显增加。两组小鼠之间的游泳速度没有显著区别。这说明WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植能够改善APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力。3.2 WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植明显降低了APP/PS1双转基因小鼠脑内老年斑的沉积和可溶性Aβ的水平。在第一次心内注射4周后,我们采用硫磺素S染色测量皮层和海马老年斑沉积面积。结果显示,WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植后,皮层和海马的老年斑面积和数量显著减少。采用ELISA法定量检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42水平,结果显示,WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞治疗能显著降低APP/PS1双转基因小鼠脑内可溶性Aβ40和Aβ42的含量。以上结果表明WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植显著降低了APP/PS1双转基因小鼠脑内的Aβ水平。3.3 WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植对AD动物模型的神经保护作用机制的研究3.3.1 WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞增加了APP/PS1双转基因小鼠血清抗炎因子IL-10和TGF-β1的水平,并显著降低了APP/PS1双转基因小鼠血清促炎因子的水平,抑制了炎症反应。在Morris水迷宫实验后,用ELISA法检测了血清促炎因子IFN-γ与血清抗炎细胞因子IL-10和TGF-β1的含量,结果显示,与接受PBS的APP/PS1双转基因小鼠相比,WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞治疗使小鼠血清抗炎细胞因子TGF-β1和IL-10的水平都显著增加,并显著降低了血清促炎因子IFN-γ的含量。3.3.2 WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞抑制了小胶质细胞的活化。第一次心内注射4周后,使用Iba-1抗体标记小胶质细胞并通过荧光免疫组织化学方法分析APP/PS1双转基因小鼠脑内小胶质细胞的状态。我们观察到,CD4+CD25+调节性T细胞治疗后大多数的皮层小胶质细胞表现为细胞体较小,突起细长,而用PBS处理后皮层小胶质细胞表现为胞体变大,突起变短,此外,我们发现,CD4+CD25+调节性T细胞治疗显著减少了活化的小胶质细胞的数量。结论1.尾静脉注射WJ-MSCs能够改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能,降低小鼠脑内老年斑的沉积。2.WJ-MSCs的作用机制与抑制炎症反应有关,增加了抗炎因子的表达、降低了促炎因子的表达和抑制促炎性小胶质细胞的激活。3.WJ-MSCs提高了APP/PS1双转基因小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例和功能。4.WJ-MSCS共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞移植改善了APP/PS1双转基因小鼠的认知功能,降低了小鼠脑内老年斑的沉积。5.WJ-MSCs共培养后分选的CD4+CD25+调节性T细胞的作用机制与抑制炎症反应有关,增加了抗炎因子的水平、降低了促炎因子的水平并抑制了小胶质细胞的活化。