高血压是一种高发病率、多并发症的危险疾病。降血压肽(AHP)是一类能够降低人体血压的多肽的总称，它是血管紧张素转化酶(ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的。降血压肽毒副作用低、降压效果明显、来源广泛，已成为目前研究的热点。目前降血压肽的制备主要采用酶解法，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题而无法实现产业化。利用基因工程技术生产降血压肽可能克服这些问题，便于进行大规模生产，发展前景广阔。 本研究利用课题组构建成功的基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)，进行了重组降血压肽的高效表达研究，并对表达产物AHP进行分离纯化，最后对纯化所得的AHP进行生物学活性鉴定。主要研究内容和结果如下： 重组质粒pGEX-4T-2-A-HP在宿主菌Ecoli BL21中具有很好的分离稳定性和结构稳定性。 采用正交设计对工程菌的培养基配方及融合蛋白GST-AHP的表达条件进行优化。得到最佳发酵培养基配方为：胰蛋白胨26g/L，酵母提取物19g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖5g/L，KC14 mmol/L，MgCl<,2> 10mmol/L；最佳培养及诱导条件：温度30℃，起始pH 7.0，装液量5％(v/v)，接种量5％(v/v)，培养至OD<,600>值1.5，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h。在此优化条件下，可溶性融合蛋白GST-AHP的表达量可达1.9 g/L，占总GST-AHP的76％，总表达量比优化前提高67％。 对降血压肽的分离纯化工艺进行了优化研究。细胞破碎的最佳方法及条件为：每克湿菌体悬于3mLl×PBS中，加溶菌酶至终浓度1mg/mL，冰置30 min，-70℃反复冻融7次，加20％(v/v)Triton X-100至终浓度1％(v/v)，温和混合30 min，分别加入Dnase和Rnase至终浓度5μg/mL，4℃震荡温育10 min，12000 g离心10 min，收集上清液。GST-AHP亲和层析最佳条件：上柱量4 mg(GST-AHP)/mL(medium bed)，上柱流速1.5 mL/min，上柱1次，上样结束后用1×PBS洗杂蛋白至OD<,280>不变，洗脱用1倍柱床体积还原型谷胱甘肽洗脱液、反应10 min，收集洗脱液，重复3次；此条件下融合蛋白吸附量达3.86 mg/mL(mediumbed)，GST-AHP回收率达96.5％。凝血酶酶切GST-AHP最佳条件：1 mg GST-AHP添加凝血酶15 U，22℃酶切8 h；此条件下，可得降血压肽102μg。RP-HPLC纯化降血压肽的最佳条件：CAN浓度12％(v/v)，’TFA浓度0.05％(v/v)，洗脱速度1.0 mL/min；或选择CAN浓度12％(v/v)，TFA浓度0.03％(v/v)，洗脱速度0.8 mL/min，在这两个条件下纯化都可实现完全分离。 另外，进行了GST-AHP融合蛋白胰蛋白酶酶切实验，lmg GST-AHP可以得到100μg AHP，与凝血酶切所得量相近。重组降血压肽生物学活性鉴定表明，其IC<,50>为4.6μmol/L；重组降血压肽对ACE的抑制类型为竞争性抑制，Km值为1.95mmol/L。