论文部分内容阅读
心血管疾病是临床上最常见、对人类健康和生命危害最大的杀手,是全球范围的重大公共问题,如何降低其发病及致残、致死率,是我们广大医务工作者的首要解决的问题。无论是高血压、冠心病还是心肌病等疾病,其共同的病理改变是促进和导致心肌细胞的重构与死亡,特别是如何挽救濒死的心肌细胞,保护心脏的收缩功能,是抢救生命和改善生存质量的关键措施。而在心肌细胞受损死亡中主要有坏死和凋亡两种方式,心肌细胞的坏死是一种不可逆转的病理过程,而心肌细胞的凋亡则可以通过干预被逆转,是挽救受损心肌的主要方式。因此,及时的干预并逆转心肌细胞的凋亡结局是临床上治疗各类心脏疾病,保护心脏功能的重要手段。为此,人们在不断积极探索和开发各类具有保护心肌细胞的药物。双去甲氧基姜黄素(BDMC)是传统中药姜黄根茎中的提取成分,与姜黄素相比具有更好的生物利用度和稳定性,而且也具有良好的抗氧化、抗炎功能。研究显示BDMC能抑制血管平滑肌迁移和增殖,改善高脂饮食导致的小鼠肥胖,同时还能减轻细胞老化。基于该化合物有良好的药理学效应和稳定的化学特性,那么,它对各类损伤性心肌细胞发生凋亡是否也有保护作用呢?机制如何?这个科学问题正是本研究的主要目的。Nrf2/ARE通路目前被认为是细胞内源性抵抗氧化应激的关键机制。核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是重要的内源性抗氧化反应核转录因子。在氧化应激条件下被激活入核与抗氧化反应原件ARE结合启动下游抗氧化应激相关的蛋白与酶表达,在心脏及其他器官的抗氧化应激反应、抗炎以及抗凋亡中起到非常重要的作用。然而,对于BDMC素和Nrf2的研究甚少,关于BDMC是否能在心肌中激活Nrf2对心肌起到保护作用,目前尚不清楚。所以,本研究拟应用星形孢菌素诱导小鼠心肌凋亡并观察BDMC的保护作用,进一步探讨Nrf2/HO-1通路在其保护心肌中的意义。研究目的1.应用星形孢菌素诱导的小鼠心肌凋亡模型,观察BDMC对心肌细胞凋亡的影响。2.探讨Nrf2/HO-1通路在BDMC心肌保护中的作用及其机制。研究方法1.培养原代心肌细胞:常规取C57小鼠乳鼠(1-2天)心脏、剪碎、胶原酶消化、差速贴壁分离心肌细胞并培养。2.使用星形孢菌素(STS)建立心肌凋亡模型:4μM STS作用原代小鼠心肌细胞8h,通过检测心肌胞生存率、caspase-3酶活性、TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,确定心肌细胞凋亡模型。3.实验分组组别有:对照组、STS组、BDMC+STS组、BDMC+STS+Sn PPⅨ组、BDMC+STS+LY294002组、BDMC+STS+PD98059组、BDMC组4.CCK-8法检测相应各组心肌胞生存率5.荧光定量法检测相应各组caspase-3酶活性6.TUNEL法检测相应各组心肌细胞凋亡7.荧光定量法检测相应各组心肌细胞内ROS水平8.Western-blot检测相应各组总的Nrf2、HO-1、p-Akt、p-ERK的表达水平及胞浆与胞核Nrf2水平9.免疫荧光观察各组的Nrf2的入核转位情况10.使用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002和MEK/ERK的通路抑制剂PD98059以及Nrf2/HO-1通路抑制剂Sn PPⅨ。研究结果1.与对照组相比,STS组心肌细胞生存率明显下降(P<0.05,n=10);与STS组相比较,BDMC+STS组心肌细胞生存率明显提高(P<0.05,n=10);与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+Sn PPⅨ组及BDMC+STS+LY294002组心肌细胞存活率又明显降低(P<0.05,n=10),而BDMC+STS+PD98059组心肌细胞存活率无明显变化(P>0.05,n=10)。2.与对照组比较,STS组心肌细胞caspase-3酶活性明显增加(P<0.05,n=10);与STS组相比较,BDMC+STS组心肌细胞caspase-3酶活性显著降低(P<0.01,n=10);与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+LY294002组心肌细胞caspase-3酶活性明显升高(P<0.01,n=10),而BDMC+STS+Sn PPⅨ组及BDMC+STS+PD98059组心肌细胞caspase-3酶活性无明显变化(P>0.05,n=10)。3.与对照组比较,STS组心肌细胞TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.05,n=5);与STS组比较,BDMC+STS组能减少TUNEL阳性细胞数,明显降低心肌细胞凋亡指数(P<0.01,n=5);而与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+Sn PPⅨ组TUNEL阳性细胞数量增加,即不能减轻心肌细胞凋亡(P<0.01,n=5)。4.与对照组相比,STS组心肌细胞内ROS水平明显增加(P<0.05,n=8);与STS组相比较,BDMC+STS组能显著降低心肌细胞内ROS水平(P<0.01,n=8)。5.与STS组相比较,BDMC+STS组能HO-1、p-Akt、p-ERK的蛋白水平明显升高(P<0.05,n=5),与对照组相比BDMC组HO-1、p-Akt、p-ERK的蛋白水平也明显升高(P<0.05,n=5)6.与STS组和对照组相比,免疫荧光显示BDMC+STS组以及BDMC组细胞核Nrf2明显增加,细胞浆Nrf2有减少趋势。Wstern-blot显示,与STS组和对照组相比,BDMC+STS组和BDMC组细胞核Nrf2水平明显升高(P<0.05,n=5),浆Nrf2减少(P<0.05,n=5)。7.加入LY294002和PD98059后,免疫荧光显示与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+LY294002组核Nrf2水平减少,胞浆Nrf2水平升高,而BDMC+STS+PD98059组胞核Nrf2未见明显减少,胞浆Nrf2未见明显改变。Western显示,与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+LY294002组核Nrf2水平减少,胞浆Nrf2水平升高(P<0.05,n=5),而BDMC+STS+PD98059组细胞浆Nrf2水平与BDMC+STS组相比无差异(P>0.05,n=5),细胞核Nrf2水平有所下降(P<0.05,n=5)。8.使用LY294002和PD98059后,与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+LY294002组p-Akt的升高水平得到明显抑制,HO-1的表达显著下降(P<0.05,n=5)。而与BDMC+STS组相比,BDMC+STS+PD98059组p-ERK升高水平虽然受到明显抑制(P<0.05,n=5),HO-1的表达有下调但不显著(P<0.05,n=5)。研究结论1.BDMC通过提高心肌存活率、降低caspase-3活性,有效的抑制了STS诱导的原代心肌细胞凋亡,具有良好的心肌保护作用。2.BDMC是Nrf2的激动剂,主要通过PI3K/Akt途径激活Nrf2/HO-1信号分子发挥了抑制心肌细胞凋亡的作用。