论文部分内容阅读
烟草是诱发食管癌的主要因素。其中，4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)是香烟烟雾多种致癌物质中含量最高的一类烟草特异亚硝胺，它可以诱导动物肺癌，食管癌，口腔癌等癌症的发生。另外，近来有关HPV与食管癌相关性的研究相继被报道，但差异性很大。流行病学证据表明HPV能与烟草烟雾产生协同致癌作用。在现有的研究基础上，我们提出一个假设，食管癌的发生是否与NNK及HPV的连续或相继暴露有关系。为了验证这个假设，本研究应用人食管上皮永生化细胞SHEE和转染HPV18E6E7的SHEE细胞分别暴露在NNK中，观察其在细胞迁移和克隆形成等能力的变化情况。在此基础上通过Westernblot和免疫组化等方法观察PCNA，ERK，p-ERK，AKT，p-AKT等蛋白的表达情况，探讨其发生机制。
1NNK与HPV18E6E7协同作用下的SHEE细胞恶性转化
细胞划痕结果显示，将转染HPV18E6E7的SHEE细胞暴露于NNK中，与SHEE的空载处理组细胞暴露于NNK中相比，其细胞迁移率明显增高;与非暴露NNK的HPV18E6E7的SHEE细胞相比，其细胞迁移率也明显增高。而且迁移增高效果在0～0.01mM浓度范围内具有剂量依赖性。细胞克隆形成实验结果与细胞划痕实验结果趋势相似。说明NNK的暴露可显著促进SHEE细胞的迁移能力和增殖能力(p＜0.01)，且与HPV18E6E7呈现出明显协同作用。
2NNK与HPV18E6E7协同作用导致SHEE细胞HPB形成的HPLC-MS/MS分析
已知NNK导致细胞DNA损伤后形成的POB-DNA加合物可经酸性水解转化为4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，因此为进一步明确该协同作用，通过测定HPB含量即可反映NNK对细胞DNA损伤的影响。首先建立了HPB的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)定量检测的方法，采用选择反应扫描模式(SRM)检测HPB的离子通道以及和[D4]HPB内标的离子通道。通过方法学研究，表明该方法有良好的灵敏度(检出限为5fmol、定量限为15fmol)、稳定性(日内和日间RSD均小于5％)和准确性(加标回收率70.6％-80.7％)。然后，基于以上定量方法对NNK导致细胞DNA损伤后释放的HPB进行了定量分析。采用不同浓度NNK处理SHEE-E6E7和SHEE-V细胞后，经DNA提取、酸性水解、固相萃取纯化和浓缩收集后，再定量测定样品中的HPB。该结果显示，用不同浓度NNK处理后的SHEE-E6E7细胞中HPB水平均显著高于相应浓度NNK处理的SHEE-V细胞(p＜0.01)。由此可见，HPV18E6E7可促进SHEE细胞中NNK的代谢，使DNA损伤累积增加，为前述细胞实验的结果提供了合理依据。
3NNK和HPV18E6E7在人食管上皮永生化细胞中协同致癌的作用机制
3.1NNK和HPV18E6E7可以显著上调SHEE细胞增殖细胞核抗原蛋白PCNA的表达
为了进一步研究NNK和HPV18E6E7在人食管上皮永生化细胞中协同致癌的作用机制，本研究应用免疫组化技术观察了人食管上皮永生化细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达。结果显示:暴露在NNK中的SHEE-E6E7细胞中的PCNA蛋白阳性颗粒比暴露在NNK中的SHEE细胞和未暴露于NNK中的SHEE-E6E7细胞的阳性颗粒有明显颜色变深和数量增多。本研究还观察了ESCC组织切片中PCNA的蛋白表达。结果显示:吸烟且HPV阳性组的食管鳞癌上皮组织中PCNA的蛋白阳性颗粒比吸烟者正常食管上皮组织中以及非吸烟且HPV阳性组食管鳞癌上皮组织中的PCNA的蛋白阳性颗粒明显升高。以上结果提示:NNK的暴露和HPV18E6E7可以显著上调PCNA的蛋白表达。
3.2NNK和HPV18E6E7的协同致癌作用可能是通过活化ERK信号通路实现的
本研究还进一步应用westernblot技术观察了SHEE细胞中ERK，p-ERK，AKT，p-AKT等蛋白的表达。结果显示:NNK处理后，SHEE-E6E7细胞与NNK处理后的SHEE空载处理组和未暴露于NNK中的SHEE-E6E7细胞相比，p-ERK的蛋白表达有明显上调，但是p-AKT蛋白几乎无明显表达。根据以上结果推测，NNK的暴露和HPV18E6E7的协同作用可能通过上调ERK蛋白来实现的。
4ERK特异性抑制剂SCH772984可以反转NNK与HPV18E6E7协同作用下的细胞恶性转化
4.1ERK特异性抑制剂SCH772984可以抑制SHEE细胞ERK蛋白的活化
为了进一步验证上述实验结果，本研究在NNK处理SHEE细胞之前，先应用ERK特异性抑制剂SCH772984(5μM)处理细胞以此来抑制ERK信号通路，观察ERK，p-ERK蛋白的表达情况，结果显示:SCH772984处理细胞后，不管是否暴露于NNK中，SHEE-E6E7细胞和SHEE-V组细胞的p-ERK蛋白的表达均显著下降，说明SCH772984可以显著抑制ERK蛋白的活性。
4.2ERK特异性抑制剂SCH772984可以抑制NNK与HPV18E6E7协同作用下的迁移率和克隆形成能力
本实验进一步观察了应用SCH772984后，暴露于NNK中转染HPV18E6E7组SHEE细胞的细胞迁移率和克隆形成率。结果显示:与未应用SCH772984组相比，SCH772984处理后的暴露于NNK中的转染HPV18E6E7SHEE细胞的细胞迁移率和克隆形成率有明显下降;且反转了NNK和HPV18E6E7协同上调细胞迁移率和克隆形成率的作用。以上结果提示，ERK特异性抑制剂SCH772984可以反转NNK与HPV18E6E7协同作用下的细胞恶性转化，进一步说明NNK与HPV18E6E7协同作用是通过活化ERK通路实现的。
本研究应用转染HPV18E6E7基因的SHEE-E6E7细胞及空载对照组SHEE-V细胞，通过细胞表型实验比较了NNK的暴露对两种细胞恶性变化的影响，并利用HPLC-ESI-MS/MS法对NNK造成两种细胞DNA的损伤后而形成的HPB进行了定量测定，证明了NNK与HPV能够具备协同致癌作用，并确证了二者能够协同促进DNA损伤的累积。本研究还进一步应用免疫组化实验和Westernblot实验观察了NNK与HPV共同作用下，PCNA，ERK，p-ERK，AKT，p-AKT等蛋白的表达情况，通过应用ERK特异性抑制剂SCH772984后，细胞表型的变化以及ERK，p-ERK等蛋白的表达情况，证明了NNK与HPV协同致癌作用可能通过上调PCNA蛋白和活化ERK信号通路实现的。本实验为阐明NNK与HPV的协同致癌作用机理提供了直接实验证据，而且对相关癌症的防治存在着重要意义。
1NNK与HPV18E6E7协同作用下的SHEE细胞恶性转化
细胞划痕结果显示，将转染HPV18E6E7的SHEE细胞暴露于NNK中，与SHEE的空载处理组细胞暴露于NNK中相比，其细胞迁移率明显增高;与非暴露NNK的HPV18E6E7的SHEE细胞相比，其细胞迁移率也明显增高。而且迁移增高效果在0～0.01mM浓度范围内具有剂量依赖性。细胞克隆形成实验结果与细胞划痕实验结果趋势相似。说明NNK的暴露可显著促进SHEE细胞的迁移能力和增殖能力(p＜0.01)，且与HPV18E6E7呈现出明显协同作用。
2NNK与HPV18E6E7协同作用导致SHEE细胞HPB形成的HPLC-MS/MS分析
已知NNK导致细胞DNA损伤后形成的POB-DNA加合物可经酸性水解转化为4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，因此为进一步明确该协同作用，通过测定HPB含量即可反映NNK对细胞DNA损伤的影响。首先建立了HPB的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)定量检测的方法，采用选择反应扫描模式(SRM)检测HPB的离子通道以及和[D4]HPB内标的离子通道。通过方法学研究，表明该方法有良好的灵敏度(检出限为5fmol、定量限为15fmol)、稳定性(日内和日间RSD均小于5％)和准确性(加标回收率70.6％-80.7％)。然后，基于以上定量方法对NNK导致细胞DNA损伤后释放的HPB进行了定量分析。采用不同浓度NNK处理SHEE-E6E7和SHEE-V细胞后，经DNA提取、酸性水解、固相萃取纯化和浓缩收集后，再定量测定样品中的HPB。该结果显示，用不同浓度NNK处理后的SHEE-E6E7细胞中HPB水平均显著高于相应浓度NNK处理的SHEE-V细胞(p＜0.01)。由此可见，HPV18E6E7可促进SHEE细胞中NNK的代谢，使DNA损伤累积增加，为前述细胞实验的结果提供了合理依据。
3NNK和HPV18E6E7在人食管上皮永生化细胞中协同致癌的作用机制
3.1NNK和HPV18E6E7可以显著上调SHEE细胞增殖细胞核抗原蛋白PCNA的表达
为了进一步研究NNK和HPV18E6E7在人食管上皮永生化细胞中协同致癌的作用机制，本研究应用免疫组化技术观察了人食管上皮永生化细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达。结果显示:暴露在NNK中的SHEE-E6E7细胞中的PCNA蛋白阳性颗粒比暴露在NNK中的SHEE细胞和未暴露于NNK中的SHEE-E6E7细胞的阳性颗粒有明显颜色变深和数量增多。本研究还观察了ESCC组织切片中PCNA的蛋白表达。结果显示:吸烟且HPV阳性组的食管鳞癌上皮组织中PCNA的蛋白阳性颗粒比吸烟者正常食管上皮组织中以及非吸烟且HPV阳性组食管鳞癌上皮组织中的PCNA的蛋白阳性颗粒明显升高。以上结果提示:NNK的暴露和HPV18E6E7可以显著上调PCNA的蛋白表达。
3.2NNK和HPV18E6E7的协同致癌作用可能是通过活化ERK信号通路实现的
本研究还进一步应用westernblot技术观察了SHEE细胞中ERK，p-ERK，AKT，p-AKT等蛋白的表达。结果显示:NNK处理后，SHEE-E6E7细胞与NNK处理后的SHEE空载处理组和未暴露于NNK中的SHEE-E6E7细胞相比，p-ERK的蛋白表达有明显上调，但是p-AKT蛋白几乎无明显表达。根据以上结果推测，NNK的暴露和HPV18E6E7的协同作用可能通过上调ERK蛋白来实现的。
4ERK特异性抑制剂SCH772984可以反转NNK与HPV18E6E7协同作用下的细胞恶性转化
4.1ERK特异性抑制剂SCH772984可以抑制SHEE细胞ERK蛋白的活化
为了进一步验证上述实验结果，本研究在NNK处理SHEE细胞之前，先应用ERK特异性抑制剂SCH772984(5μM)处理细胞以此来抑制ERK信号通路，观察ERK，p-ERK蛋白的表达情况，结果显示:SCH772984处理细胞后，不管是否暴露于NNK中，SHEE-E6E7细胞和SHEE-V组细胞的p-ERK蛋白的表达均显著下降，说明SCH772984可以显著抑制ERK蛋白的活性。
4.2ERK特异性抑制剂SCH772984可以抑制NNK与HPV18E6E7协同作用下的迁移率和克隆形成能力
本实验进一步观察了应用SCH772984后，暴露于NNK中转染HPV18E6E7组SHEE细胞的细胞迁移率和克隆形成率。结果显示:与未应用SCH772984组相比，SCH772984处理后的暴露于NNK中的转染HPV18E6E7SHEE细胞的细胞迁移率和克隆形成率有明显下降;且反转了NNK和HPV18E6E7协同上调细胞迁移率和克隆形成率的作用。以上结果提示，ERK特异性抑制剂SCH772984可以反转NNK与HPV18E6E7协同作用下的细胞恶性转化，进一步说明NNK与HPV18E6E7协同作用是通过活化ERK通路实现的。
本研究应用转染HPV18E6E7基因的SHEE-E6E7细胞及空载对照组SHEE-V细胞，通过细胞表型实验比较了NNK的暴露对两种细胞恶性变化的影响，并利用HPLC-ESI-MS/MS法对NNK造成两种细胞DNA的损伤后而形成的HPB进行了定量测定，证明了NNK与HPV能够具备协同致癌作用，并确证了二者能够协同促进DNA损伤的累积。本研究还进一步应用免疫组化实验和Westernblot实验观察了NNK与HPV共同作用下，PCNA，ERK，p-ERK，AKT，p-AKT等蛋白的表达情况，通过应用ERK特异性抑制剂SCH772984后，细胞表型的变化以及ERK，p-ERK等蛋白的表达情况，证明了NNK与HPV协同致癌作用可能通过上调PCNA蛋白和活化ERK信号通路实现的。本实验为阐明NNK与HPV的协同致癌作用机理提供了直接实验证据，而且对相关癌症的防治存在着重要意义。