半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)、掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott.)、天南星(Arisaema heterophyllum Maxim.)、白附子(Typhonium giganteum Engl.)均为天南星科有毒中药,临床误服生品或鲜品均出现强烈的刺激性毒性。课题组前期研究表明,天南星科这4种有毒中药的刺激性毒性成分同属一类,均是其含有的“毒针晶”,并发现毒针晶中带有毒蛋白,这类毒蛋白是该科属有毒中药中特有的凝集素蛋白。课题组前期研究发现凝集素蛋白可加重因毒针晶刺激导致的家兔眼结膜水肿,可导致大鼠足趾肿胀,并可诱导大鼠腹腔中性粒细胞迁移聚集,具有强烈的促炎毒性,且这种促炎作用与居留巨噬细胞密切相关,能够导致巨噬细胞的活化,但其促炎机制尚未阐明。因天南星科这4种有毒中药具有强烈的刺激性毒性,需炮制以降低毒性才能临床应用。《中国药典》及全国中药饮片炮制规范对天南星科这几种有毒中药的炮制方法均记载为采用辅料生姜、白矾以及加热的方法进行炮制,课题组前期研究发现白矾具有确切的破坏针晶结构的作用,但其对凝集素蛋白的影响还有待进一步探讨。为进一步阐明天南星科4种有毒中药中的凝集素蛋白促炎毒性机制以及炮制对凝集素蛋白的影响,本论文从细胞膜受体介导产生生物学效应的角度,深入系统的研究4种凝集素蛋白的促炎机制;采用辅料生姜、白矾以及加热的方法分别炮制4种凝集素蛋白,以研究不同炮制方法及辅料对凝集素蛋白的影响。通过上述研究,以揭示天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制及复制法炮制解毒的科学内涵,为天南星科有毒中药的饮片质量控制、临床安全应用、炮制工艺改革与创新提供科学依据和理论支撑,也为其他同科属有毒中药炮制研究提供示范和借鉴。主要研究工作如下:1.天南星科4种有毒中药凝集素蛋白与巨噬细胞的结合作用研究从天南星科植物半夏、掌叶半夏、天南星、白附子的块茎中分别提取分离纯化获得半夏凝集素(PTL)、掌叶半夏凝集素(PPL)、天南星凝集素(AEL)和白附子凝集素(TGL);采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记4种凝集素蛋白,并经流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测4种凝集素蛋白与巨噬细胞是否发生结合。流式细胞仪检测结果显示,与空白组比较,经FITC标记的不同浓度的4种凝集素蛋白(6.25、12.5、25、50μg/mL)刺激巨噬细胞1h后均能导致细胞荧光强度显著增强,表明4种凝集素蛋白均能与巨噬细胞发生结合,且随着凝集素蛋白给药剂量的增加,其结合率显著增大。共聚焦显微镜观察结果显示,4种凝集素蛋白刺激巨噬细胞1h后均能定位到巨噬细胞膜上,并且随着给药剂量的增加和刺激时间的延长,4种凝集素蛋白均逐渐进入细胞质中。以上结果表明天南星科4种凝集素蛋白能与巨噬细胞发生结合,并主要定位于细胞膜上,推测凝集素蛋白可能与细胞膜表面受体发生结合。2.天南星科4种有毒中药凝集素蛋白促炎机制研究以不同浓度的4种凝集素蛋白体外刺激RAW264.7巨噬细胞,1h后Western blot法检测巨噬细胞中MAPKs通路关键蛋白p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK以及NF-κB通路关键蛋白p-p65、p65、p-IκB、IκB的表达;并采用ELISA法检测凝集素蛋白刺激巨噬细胞后对炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放的影响。结果显示,4种有毒中药凝集素蛋白均能够激活MAPKs、NF-κB炎症信号通路,表现为p-p38、p-ERK、p-JNK、p-IKB、p-p65蛋白水平的升高。同时,4种凝集素蛋白均能够导致巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的大量释放。此结果表明天南星科有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星和白附子凝集素蛋白具有强烈的促炎毒性。炎症通路的活化以及炎症因子的释放受到上游细胞膜受体的调控,荧光标记实验表明,4种凝集素蛋白可定位于巨噬细胞膜上,定位于细胞膜上的凝集素蛋白是否与受体结合?是与哪类受体结合?本论文采用基因沉默技术,以shRNA质粒转染巨噬细胞,分别沉默6种重要的细胞膜炎症相关受体,即吞噬性受体中的SR-A和DC-SIGN,模式识别信号受体中的TLR4,细胞因子受体中的TNFR1、TNFR2和IL-1R1,并采用倒置荧光显微镜、PCR以及Western Blot法分别对沉默效率进行测定。达到基因沉默效果后,采用Western Blot和ELISA法分别检测4种凝集素蛋白刺激巨噬细胞对MAPKs、NF-κB信号通路以及对炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-6释放的影响,进而筛选可能的与凝集素蛋白结合的关键受体分子,同时采用Western Blot法对关键受体分子及其下游衔接蛋白表达进行测定,以进一步验证该受体分子是否与凝集素蛋白发生相互作用。研究结果显示,分别以shSR-A、shDC-SIGN、shTLR4、shTNFR1、shTNFR2、shIL-1R1质粒4μg转染巨噬细胞48h后,各基因的沉默效率均达到70%左右,表明以此条件转染的巨噬细胞基因沉默效果良好。与未沉默组相比,沉默受体组4种凝集素蛋白导致的MAPKs和NF-κB通路的活化程度以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放的程度均显著降低,其中以沉默TNFR1和TLR4受体组促炎作用降低最为显著,表明TNFR1和TLR4受体在4种凝集素蛋白的促炎过程中发挥重要作用。Western Blot结果显示,4种凝集素蛋白均能使细胞中TNFR1受体及下游衔接蛋白TRADD、TRAF2以及TLR4受体及下游衔接蛋白MyD88、IRAK4、TRAF6蛋白水平升高,进一步表明TNFR1和TLR4受体在4种凝集素蛋白的促炎过程中发挥重要作用。根据上述结果可推测4种凝集素蛋白与TNFR1或TLR4受体间可能存在直接的结合作用。为验证此推测,论文采用蛋白-蛋白相互作用的方法进一步研究两种受体与凝集素蛋白的结合作用。因4种凝集素蛋白目前未能检索到三维结构,故本论文采用同源建模的方法分别模拟出了4种凝集素蛋白的三维结构,进而分别与TNFR1、TLR4受体进行对接,并测定4种凝集素蛋白与TNFR1、TLR4受体的结合力。同时,采用生物膜层干涉技术(BLI)验证4种凝集素蛋白与TNFR1、TLR4受体的亲和作用,测定其亲和力。蛋白-蛋白对接结果表明,4种凝集素蛋白与TNFR1受体的结合力均远大于TNFR1特异性蛋白配体(TNF-β)与TNFR1受体的结合力,且半夏凝集素与TNFR1受体的结合力约是TNFR1特异性蛋白配体(TNF-β)与TNFR1受体结合力的2倍;而4种凝集素蛋白与TLR4受体的结合力与TLR4特异性蛋白配体(MD-2)与TLR4受体结合力相接近。BLI研究结果表明,4种凝集素蛋白与TNFR1的亲和常数在5～8×10-8mol/L之间;4种凝集素蛋白与TLR4的亲和常数在2× 10-6～4× 10-5mol/L之间。亲和常数越小,分子间的结合越牢固。故上述结果表明,与TLR4受体相比,TNFR1受体与4种凝集素蛋白具有更强的亲和作用。研究结果表明,天南星科4种凝集素蛋白与TNFR1受体具有强烈的亲和作用,TNFR1受体应该是4种凝集素蛋白发挥促炎作用的主要分子靶点,而TLR4受体与4种凝集素也有一定的结合力,是促炎作用的次要靶点。3.半夏凝集素干预的巨噬细胞转录组测序为深入研究凝集素对巨噬细胞的作用,本论文采用转录组测序的方法考察凝集素蛋白对巨噬细胞基因表达和功能的影响。以半夏凝集素为模式蛋白,50μg/mL的剂量刺激巨噬细胞1h后,利用Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序,构建半夏凝集素干预的巨噬细胞转录组文库,并用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。通过测序评估和基因表达量分析,结果显示半夏凝集素刺激巨噬细胞后,共获得巨噬细胞652种差异表达基因,其中上调基因616个,且其中有43个基因与炎症密切相关,下调基因36个。功能分析显示半夏凝集素主要影响巨噬细胞的分子功能、生物过程以及细胞组成。代谢通路分析表明半夏凝集素刺激巨噬细胞后,主要影响细胞中的TNF信号通路、MAPK信号通路等。此结果与凝集素蛋白和TNF受体结合并激活MAPK、NF-κB信号通路导致炎症因子大量释放的结果一致。4.炮制对天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的影响天南星科4种有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星和白附子均具有强烈的促炎毒性,故临床上常采用白矾水浸泡或生姜加白矾加热煮制的方法进行炮制以降低毒性。本论文采用白矾水浸泡和生姜加上白矾并加热煮制的方法炮制4种有毒中药,研究炮制对凝集素蛋白的影响。采用Western Blot法半定量测定半夏、掌叶半夏、天南星、白附子及其不同炮制品中凝集素蛋白的含量。分别单独以生姜汁浸泡、白矾水浸泡、加热煮制4种有毒中药及凝集素蛋白,考察不同炮制方法对4种凝集素蛋白含量的影响;采用SDS-PAGE法结合银染技术鉴定4种凝集素经炮制后的蛋白沉淀;采用MALDI-TOF检测不同炮制方法对4种凝集素蛋白一级结构的影响。结果表明,生掌叶半夏、生半夏、生天南星和生白附子中各凝集素蛋白的含量分别为7.3%、4.9%、2.7%、2.3%,白矾炮制后的清半夏中半夏凝集素的含量为0.027%,而姜半夏、制天南星和制白附子中均未检测到活性凝集素蛋白。加热煮制能够导致4种活性凝集素含量大大降低,白矾水浸泡同样降低4种活性凝集素蛋白的含量,而生姜汁浸泡对活性凝集素蛋白的含量基本无影响。SDS-PAGE法结合银染技术以及MALDI-TOF结果显示,采用白矾水浸泡以及单独加热煮制的方法进行炮制,可导致凝集素蛋白变性的同时发生降解,从而导致具有活性的凝集素蛋白的含量显著降低。研究结果表明,炮制工艺和辅料中以白矾水浸泡和加热煮制这4种有毒中药可降低其毒性,但单独采用生姜汁浸泡无显著降毒作用。这解释了采用白矾水浸泡和生姜加白矾煮制的工艺能够一直沿用至今,而单独姜浸炮制工艺己被淘汰的原因。本论文深入研究了天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制,结合课题组前期研究结果,论文揭示了天南星科有毒中药产生强烈的刺激性致炎毒性的机制是:4种有毒中药块茎中的毒针晶可刺入机体组织,针晶及块茎中的凝集素蛋白可随针晶进入组织,与组织巨噬细胞膜上的TNFR1、TLR4受体结合,诱导氧化应激,并激活下游MAPK、NF-κB及NLRP3信号通路,导致炎症因子大量释放,并进一步促发炎症级联反应,导致强烈的炎症刺激性毒性。复制法炮制解毒的机制在于,白矾可破坏4种有毒中药中针晶的结构,同时辅料白矾以及加热煮制的方法能够导致凝集素蛋白变性或降解,从而显著降低刺激性毒性;单独以生姜汁浸泡不能破坏凝集素蛋白,而生姜加上白矾煮制的炮制技术主要是白矾和加热的作用。本论文的研究结果明确地揭示了天南星科4种有毒中药凝集素蛋白的促炎毒性机制以及复制法炮制解毒的关键科学内涵,为天南星科及其他科属有毒中药的饮片质量控制、炮制工艺改革与创新提供示范和借鉴。