研究背景脓毒症是由感染引起的生理、病理和生化异常综合征,是全球范围内影响公众健康的重大公共卫生问题。最新的国际共识将脓毒症定义为宿主对感染的反应失调,并产生危及生命的器官功能障碍。脓毒症常并发于严重烧伤、创伤及外科大手术等,是一种发病率高、病死率高、医疗负担高的感染性疾病。最近的流行病学数据显示,脓毒症的发病率接近450/10万,远远超过心肌梗死,或前列腺癌、乳腺癌和肺癌的总和。据估计,全世界每年有将近1500万到3000万脓毒症病例发生,总病死率在30%到50%之间。来自美国的调查数据显示,2011年,用于脓毒症治疗的费用已经超过200亿美元,占当年美国医院临床总费用的5.2%。因此,脓毒症仍然是威胁人类健康和经济发展的重大挑战。目前,脓毒症发病机制还不明确,深入研究脓毒症发病机制,寻找新的防治途径,已成为国际危重症医学领域的迫切任务。持续的感染和炎症反应在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用。病原体侵入机体后,首先激活宿主的固有免疫,导致大量炎症因子释放,若机体免疫细胞能及时杀灭病原体,进而控制炎症反应,脓毒症将趋于好转。如果引起脓毒症的病原体持续存在,则会激活级联反应导致自我放大细胞因子的产生,引发“细胞因子风暴”,进而导致全身炎症反应综合征(SIRS)。细胞因子风暴是以往研究和关注的重点,其激活以及后续发展可损伤机体的细胞,甚至可导致细胞死亡。这个过程中,免疫细胞也会出现损伤、失活、凋亡,其功能和数量均下降,机体进而进入免疫抑制状态,导致病原体的清除能力显著降低和二次感染,最终出现危及生命的器官功能障碍,并影响脓毒症患者的预后。因此,怎样有效地增强病原体清除并合理调控炎症反应,已成为亟需解决的科学难题和研究热点。巨噬细胞是单核吞噬细胞系统中的重要先天免疫细胞,其对增强机体防御、促进组织发育和维持机体稳态起着至关重要的作用,并且是机体防御病原微生物入侵的第一道防线。巨噬细胞基本上存在于各个器官或组织中,但在胃肠道、肝脏、脾脏、上呼吸道和脑组织中更丰富。巨噬细胞在脓毒症发生发展的各个阶段都发挥着重要作用,其功能主要分为两个方面:第一,对病原微生物的识别、吞噬和清除。当病原微生物侵入机体时,巨噬细胞可通过表面的受体识别病原微生物,并将其吞噬、消化,再经过抗原提呈作用呈递给T淋巴细胞,并促进其产生大量炎症细胞因子以调节适应性免疫。巨噬细胞的吞噬作用对于感染病原体的清除和衰老细胞的摄取、降解至关重要。第二,巨噬细胞可以极化为M1和M2两种类型。M1巨噬细胞(经典活化的巨噬细胞)能够释放大量炎症细胞因子,促进炎症的形成,而M2巨噬细胞(替代性活化的巨噬细胞)则具有抗炎症反应和促进组织重塑的功能。因此,增强巨噬细胞的吞噬功能,降低其炎症因子的释放可以有效防御病原体入侵,降低脓毒症的发生,改善脓毒症的预后。生长分化因子3(GDF3),作为转化生长因子β(TGF-β)超家族一员,也被称为Vg的相关基因2(Vgr-2),是由GDF3基因编码的蛋白质;并被细分为该家族的骨形态发生蛋白/生长分化因子(BMP/GDF)分支。GDF3在胚胎骨和成人骨髓、胸腺、脾脏和脂肪中有表达。既往研究发现其在眼睛和骨骼发育中起着重要作用;研究还发现GDF3是肌肉再生的调节剂,以旁分泌的方式维持巨噬细胞在组织修复方面的功能。进一步的研究还发现GDF3可抑制MCF-7和T47D细胞的增殖,并且在乳腺癌组织中的表达水平显著下降。此外,GDF3的过表达可以促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。但GDF3对巨噬细胞功能的影响以及其在急性炎症期间,尤其是脓毒症导致的急性炎症期间的作用尚无研究。本论文拟对GDF3对脓毒症小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响及机制进行研究。研究目的1.探究GDF3对CLP诱导的脓毒症小鼠的生存保护作用。2.研究GDF3对脓毒症小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响,探究其抗炎保护效应。3.研究GDF3促进巨噬细胞吞噬功能的相关机制。研究方法1.建立小鼠CLP模型。将小鼠随机分为CLP-BSA对照组和CLP-GDF3处理组,每组20只,进行CLP手术前3小时,分别经尾静脉注射0.1%BSA和GDF3。进行CLP手术。术后观察CLP小鼠7天生存率,以探究GDF3对CLP诱导的脓毒症小鼠生存率的影响。2.在CLP术后12h,将小鼠麻醉后,采用心脏采血法收集小鼠血液样本,并进行腹腔灌洗收集腹腔灌洗液样本。将血液样本和腹腔灌洗液样本稀释后均匀涂布于TSA绵羊血培养基上,测定CLP小鼠血液和腹腔灌洗液样本细菌负荷。以探究GDF3对CLP手术后小鼠感染程度的影响。3.在CLP术后12h,将小鼠麻醉后,采用心脏采血法收集小鼠血液样本,并进行腹腔灌洗收集腹腔灌洗液样本。通过ELISA测定血清和腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-a)和白介素-6(IL-6)的水平。以探究GDF3对CLP诱导的早期脓毒症小鼠血液和腹腔灌洗液样本中促炎细胞因子的影响。4.分离和培养骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),培养RAW264.7细胞,用MTS法检测不同处理浓度GDF3对BMDMs和RAW264.7细胞活性的影响。5.分离和培养骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞,培养RAW264.7细胞,用不同的方法测定GDF3对不同巨噬细胞吞噬及杀菌功能的影响。6.提取GDF3处理后的BMDMs的总RNA进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),分析对照组样本与GDF3处理组样本基因表达情况,以筛选出与GDF3增强巨噬细胞吞噬功能相关的候选基因,并应用qPCR对筛选出的基因进行定量分析,以验证其表达。7.分离和培养骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),分别用GDF3和LXR激动剂处理后,用免疫荧光染色法检测LXR的核转运,以探究GDF3对LXR的作用。8.分离和培养骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),通过酶标仪定量检测分别用GDF3、LXR激动剂、LXR拮抗剂和GDF3+LXR拮抗剂处理后的BMDMs吞噬荧光标记的E.coli Bioparticles的能力。同时通过共聚焦显微镜监测分别用LXR激动剂和LXR拮抗剂+GDF3处理后的BMDMs吞噬荧光标记的E.coli Bioparticles的情况,进一步探究GDF3促进巨噬细胞吞噬功能的相关机制。9.统计学分析:使用 GraphPad Prism 7.0 软件(GraphPad Software,Inc.,美国)进行统计学分析及作图。本实验数据用均数±标准差表示。两组数据间比较使用非配对双尾t检验分析显著性差异,生存率应用log rank检验分析显著性差异。P<0.05被认为具有显著的统计学意义。结果1.GDF3对脓毒症小鼠生存率的影响:GDF3预处理组脓毒症小鼠的7天生存率显著高于对照组(0.1%BSA预处理组),说明GDF3能够提高CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率。2.GDF3对脓毒症小鼠血液和腹腔灌洗液样本细菌负荷的影响:不论是在血液还是腹腔灌洗液中,GDF3预处理组细菌负荷均较对照组显著降低,表明GDF3可减轻CLP手术后小鼠的感染程度。3.GDF3对脓毒症小鼠血清和腹腔灌洗液样本中促炎细胞因子水平的影响:与对照组相比,GDF3组脓毒症小鼠血清和腹腔灌洗液中TNF-α和IL-6的水平均较对照组显著下降。说明GDF3可抑制促炎细胞因子的释放从而降低早期脓毒症小鼠的炎症反应。4.不同处理浓度GDF3对BMDMs和RAW264.7细胞活性的影响:使用浓度为10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml的GDF3处理的两种细胞活性均没有显著变化。但高浓度的GDF3(100ng/ml)显著降低了两种细胞的活性。结果表明,高浓度GDF3可能对巨噬细胞存在潜在的细胞毒性。5.分别用酶标仪、共聚焦显微镜、流式细胞仪对不同种的巨噬细胞吞噬荧光标记的E.coli Bioparticles的能力进行检测,均发现与对照组相比,GDF3处理可显著增强各种巨噬细胞对荧光标记的E.coli Bioparticles的吞噬功能。GDF3还可增强巨噬细胞对吞噬入细胞内的E.coli活菌的杀菌作用。以上结果表明GDF3对脓毒症小鼠生存率的提高可能是通过促进巨噬细胞的吞噬和杀菌作用来实现的。6.RNA-seq分析显示,GDF3可显著提高BMDMs中CD5L等基因的表达。qPCR同样证实在GDF3处理后的BMDMs中CD5L表达较对照组显著增高。因此,我们推测GDF3可能通过激活CD5L上游调控基因来促进其表达。7.GDF3可激活CD5L上游调控基因肝X受体(LXR):免疫荧光染色发现,与LXR受体激动剂GW3965处理后的BMDMs中观察到的一样,GDF3可促进BMDMs中LXR向核内转移,因此我们认为GDF3可激活CD5L上游调控基因LXR。8.LXR的激活和抑制对BMDMs吞噬功能的影响:酶标仪定量检测显示,与对照组相比,应用LXR激动剂可显著增强BMDMs对荧光标记的E.coli Bioparticles的吞噬,而使用LXR拮抗剂处理后,这种作用被阻断。共聚焦显微镜监测也得到了相似的结果。以上结果进一步证实了 GDF3是通过激活LXR-CD5L信号通路从而提高了巨噬细胞的吞噬功能。结论GDF3可通过激活LXR-CD5L信号通路增强巨噬细胞的吞噬和杀菌作用,同时降低了 CLP诱导的脓毒症小鼠的炎症反应,进而提高了 CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率。本研究是对GDF3在巨噬细胞吞噬功能方面相关作用及其机制的首次阐述,拓展了 GDF3在脓毒症方面的功能,有可能成为增强脓毒症时病原体清除的新的治疗方法。