【研究背景及目的】肝细胞癌（简称肝癌）是恶性程度很高，预后极差的恶性肿瘤。我国是肝癌高发区，肝癌的致死率居所有肿瘤的第二位。肝癌的发生可以由很多外界因素引起，如肝炎病毒感染导致慢性肝脏炎症，逐渐转变成肝硬化，最后到肝癌；肝特异性致癌物，如黄曲霉素，它能特异的破坏正常肝细胞进而诱导肝癌；还有遗传因素等等。同时也是体内多条信号通路、多个肝癌驱动基因共同作用的结果。近年来大量基础医学研究结果提示炎症是肿瘤发生和肿瘤进展的主要因素之一，多种恶性肿瘤都是由炎症诱发和促进。肝癌是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤，它经常是经历迁延不愈的慢性炎症，肝细胞的损伤，受损的肝细胞引起更高的炎症，肝细胞反复坏死增生，形成肝硬化，最终导致肝癌的发生。已有研究显示致癌基因（如编码蛋白络氨酸激酶、RAS-R、β-catenin、转录因子c-myc等）的异常激活可以诱导一些炎症化学趋化因子和炎症细胞因子的分泌，影响正常肝脏细胞微环境的重塑，从而促进肿瘤微环境形成。表观遗传学因素的改变包括染色体重排，DNA甲基化，组蛋白乙酰化，RNA编辑和microRNA等在肝癌的发生和进展过程中也起着重要的作用。比如DNA的甲基化沉默抑癌基因，去甲基化激活癌基因；和组蛋白的乙酰化激活癌基因等等。癌基因p28^GANK（又称p28，Gankyrin，PSMD10）是日本科学家从人类肝癌组织cDNA文库中筛选出来的，它编码了七个重复的ankyrin序列。我们前期研究确认p28^GANK为具有一定肝癌细胞特异性的癌蛋白，可作为肝细胞癌鉴别诊断的标志物。p28^GANK作为一重要的肝癌调控节点分子，参与调控Rb/E2F、NF-κB、p53、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等多个信号通路，促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞的凋亡、增强肝癌细胞的转移和侵袭能力等；同时，p28^GANK可调控核转录因子Oct4，提高肝癌干细胞的干性，促进肝癌进展。在肝癌的临床样本中p28^GANK的蛋白表达水平与患者术后复发转移密切相关，不仅作为分子病理分型和预后判断的指标，也是肝癌基因治疗的潜在靶点。目前我们借助肝癌基因组二代测序技术，尚未发现p28^GANK有突变或基因拷贝数的增多。由此我们推测p28^GANK在肝癌中高表达是由于其自身转录调控异常引起的。前期我室研究发现炎性因子IL-1β和TNFα可以引起p28^GANK转录活化，但是具体作用机制尚不清楚。已有诸多文献报道，作为IL-1β下游的NF-κB信号通路在炎症的相关肿瘤中扮演了举足轻重的角色，它的失调与多种肿瘤的发生发展密切相关。因此，本课题进一步研究IL-1β/IRAK-1通路上调p28^GANK的分子机制，探索其他的激活p28^GANK转录的因素，比如表观遗传学的因素。为更深的理解肝癌的发生发展机制和寻找靶向治疗肝癌有效分子靶点提供理论线索。【实验方法】1.构建含有p28^GANK启动子区的荧光报告基因质粒。2.建立稳转荧光报告基因质粒的HEK293细胞系。3.利用稳转细胞系筛选可以激活p28^GANK的细胞因子或药物。4.探索炎症因子IL-1β，甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷，组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A上调p28^GANK的机制。5.在细胞系上验证IL-1β通过促进乙酰化酶活性上调p28^GANK的可能机制。6.建立二乙基亚硝胺（DEN）诱癌大鼠模型，检测诱癌过程中血清IL-1β变化，检测在诱癌的过程中p28^GANK，p-IRAK1的表达变化。7.收集正常人、肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清，检测血清中IL-1β的水平，比较IL-1β在正常人、肝炎、肝硬化和肝癌患者中的变化情况。8.在细胞系，正常人、肝硬化和肝癌患者的肝样本中检测p-IRAK1、p28^GANK和IL-1β的表达。【实验结果】1.成功构建出含有p28^GANK启动子区的荧光报告基因质粒和稳转该质粒的HEK293细胞系。2.采用荧光报告基因系统对p28^GANK转录活性行检测，发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A和丁酸钠，炎症因子IL-1β，甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷可提高p28^GANK转录活性。3.证实IL-1β是通过磷酸化IRAK1，引起p300磷酸化激活和高表达，激活p28^GANK的转录。4. IL-1β通过使IRAK1发生磷酸化，进而激活JNK信号通路引起p300发生磷酸化激活，从而激活p28^GANK。5.在DEN诱癌模型中，血清IL-1β和蛋白水平在肝炎期表达升高，肝硬化期有所下降，肝癌时期又重新升高，p28^GANK和p-IRAK1在蛋白水平具有相同的趋势。6.肝硬化和肝癌患者血清IL-1β水平明显高于正常人，肝炎患者IL-1β水平最高，提示IL-1β在肝炎肝硬化和肝癌的进程中起一定的作用。7.证实了肝癌组织中IL-1β和IRAK1的高表达，IRAK1和p28^GANK在RNA水平和蛋白水平呈现出很好的相关性。8. p-IRAK和p28^GANK在正常肝细胞、肝癌细胞系中，正常人、肝硬化和肝癌病人临床样本上都呈现很好的相关性，说明p28^GANK的确受到IL-1β炎性信号通路调控。【结论】本研究阐明了IL-1β/IRAK1通过磷酸化激活具有乙酰化酶活性的转录辅因子p300对组蛋白进行乙酰化，从而促进p28^GANK的转录激活。确认IL-1β通过激活JNK信号通路，促使p300磷酸化激活和总蛋白的表达升高，进而控制p28^GANK转录，p28^GANK启动子区虽然检测到有甲基化位点存在，但是甲基化对其转录调节没有直接的影响。该研究为人们进一步认识慢性肝炎逐渐进展至肝癌的过程中IL-1β和癌蛋白p28^GANK起到的的作用提供了新的实验证据，有助于人们更好的理解肝癌的发生和如何进展的机制，并为肝癌的预防和治疗提供新的参考。