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王枣子(Isodon amethystoides(Benth)Cy Wu et Hsuan),学名香茶菜是种传统的药食同源、全草入药植物。《药典》记载其能消炎抗菌、袪毒清热、活血解瘀,常用来医治恶疮、蛇虫咬伤、肺结核和急性传染性肝炎等。近年来的研究显示,其内部天然活性成分种类复杂、含量丰富,含有大量能抗肿瘤的萜类成分。课题组前期对王枣子提取、分离、纯化得出2种天然活性物质——内折香茶菜苷A(Inflexuside A)和王枣子乙素(Glaucocalyxin A),并发现其具有抗肿瘤活性。因此本研究以A549(肺癌)和HepG2(肝癌)细胞为研究对象,分别将两种活性物质进行体外肿瘤细胞活性研究,通过对细胞活力、活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的检测,观察JC-1、Annexin V/PI染色,蛋白免疫印迹(Western Blot)测定等实验,探索二者的抑制肿瘤活性作用及其作用机理,为中药王枣子能够在临床上作为一种新潜在抗肿瘤药物提供理论依据和技术支持。(1)MTT实验结果显示,内折香茶菜苷A和王枣子乙素能够抑制A549和HepG2细胞的增殖,对不同细胞株,肿瘤细胞的生长抑制效果不同:其中内折香茶菜苷A对A549细胞的生长抑制作用较明显,而王枣子乙素对HepG2细胞的抗增殖作用更强。随体外给药浓度的增加、药物作用时间的增长,两种肿瘤细胞的活力均逐渐下降。形态学研究发现,经内折香茶菜苷A和王枣子乙素作用后,两种肿瘤细胞的细胞形态和结构均被不同程度破坏。(2)内折香茶菜苷A和王枣子乙素作用后,肿瘤细胞内ROS水平均显著增加,引起了肿瘤细胞的氧化应激损伤。(3)通过对药物作用前后对HepG2和A549细胞培养基上清中LDH释放率的检测,发现药物作用后细胞LDH释放率明显升高。(4)通过AV/PI染色、流式细胞仪分析,发现低浓度内折香茶菜苷A和王枣子乙素用于肿瘤细胞后,可见早期凋亡细胞数量有所增多;高浓度药物作用,细胞凋亡量不断增加,本研究表明内折香茶菜苷A和王枣子乙素对肿瘤细胞的活性抑制是由于引发了细胞凋亡造成的。(5)内折香茶菜苷A和王枣子乙素作用于两种肿瘤细胞12 h后的细胞线粒体膜电位变化情况可以看出,药物作用使线粒体膜电位下降。分别考察内折香茶菜苷A和王枣子乙素对A549和HepG2细胞质中细胞色素C(Cytochromsome C,Cyto-C)含量的影响。结果显示,对照组细胞胞质内几乎不含Cyto-C,加入药物作用后,胞质中Cyto-C的含量升高。(6)用不同浓度内折香茶菜苷A作用A549和HepG2细胞12 h后,细胞促凋亡蛋白Bax表达明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达量减少。王枣子乙素对两细胞的作用效果与内折香茶菜苷A的作用效果一致。总之,本研究初步证明了王枣子根中提取物内折香茶菜苷A和王枣子乙素对A549和HepG2细胞通过破坏线粒体膜电位,使其通透性加强,Cyto-C释放到细胞内,引发细胞凋亡信号通路,升高Bax表达,降低Bcl-2表达,最终导致细胞凋亡。