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目的:从PTEN甲基化调控PI3K/Akt通路的角度,阐明HBX抑制HepG2细胞凋亡的机制,为更深入认识HBX基因对肝癌的生物学作用机制及寻找抗癌治疗的药物新靶点奠定基础。方法:根据是否转染HBX基因及加入5-Aza-Cd R药物处理,将实验分为五组:转染pCMV(+)-HBX质粒组、转染pCMV(+)-空质粒组、空白组(未转染质粒)、转染pCMV(+)-HBX质粒+5-Aza-CdR组、转染pCMV(+)-空质粒+5-Aza-CdR组。体外培养人肝癌细胞HepG2细胞,采用瞬时转染法转染HBX基因,使用荧光显微镜观察HepG2细胞转染效率;利用流式细胞仪(FCM)检测各组HepG2细胞的凋亡水平;利用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测各组HepG2细胞中PTEN甲基化及非甲基化水平;采用RT-PCR、Western Blot检测各组HepG2细胞中PTEN、DNMT3A和p-Akt/Akt的表达。结果:基因测序结果显示成功构建了过表达重组质粒pCMV(+)-HBX。荧光显微镜观察HepG2细胞瞬时转染pCMV(+)-HBX及pCMV(+)-空质粒后,转染效率在80%之间,可用于后续实验。FCM结果显示:与转染pCMV(+)-空质粒组及空白组相比,转染p CMV(+)-HBX质粒组HepG2细胞凋亡率下降(P<0.05);与转染pCMV(+)-HBX质粒组相比,转染pCMV(+)-HBX质粒+5-Aza-CdR组Hep G2细胞凋亡率显著增加(P<0.05);转染pCMV(+)-空质粒组与空白组相比,HepG2细胞凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)。MSP结果显示:与转染pCMV(+)-空质粒组及空白组相比,转染pCMV(+)-HBX质粒组PTEN甲基化表达水平显著上调(P<0.05),非甲基化表达水平显著下调(P<0.05);与转染pCMV(+)-HBX质粒组相比,转染p CMV(+)-HBX质粒+5-Aza-CdR组PTEN甲基化表达水平显著下调(P<0.05),非甲基化表达水平显著上调(P<0.05);转染pCMV(+)-空质粒组与空白组相比,PTEN甲基化及非甲基化的表达水平的差异均无统计学意义(均P>0.05)。RT-PCR和Western Blot结果显示:与转染pCMV(+)-空质粒组及空白组相比,转染pCMV(+)-HBX质粒组PTEN mRNA和蛋白表达水平均显著下调(均P<0.05),DNMT3A和p-Akt/Akt蛋白相对表达水平均显著上调(均P<0.05);与转染pCMV(+)-HBX质粒组相比,转染pCMV(+)-HBX质粒+5-Aza-Cd R组PTEN mRNA和蛋白表达水平均显著上调(均P<0.05),DNMT3A和p-Akt/Akt蛋白相对表达水平均显著下调(均P<0.05);转染pCMV(+)-空质粒组与空白组相比,PTEN mRNA和蛋白表达水平、DNMT3A及p-Akt/Akt蛋白相对表达水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:HBX能抑制HepG2细胞凋亡,其机制可能与通过上调PTEN甲基化调控PI3K/Akt通路有关。