研究目的:各种损伤因素所导致的急慢性皮肤创伤是临床最常见的疾患之一。创伤治疗的目的是清创后采用有效手段促进创面尽快愈合,恢复受损组织的功能。已知,创面愈合是皮肤受损组织通过十分复杂但又有序的自我修复机制使整个创面恢复原貌的过程。研究表明,皮肤损伤修复过程不但存在皮肤内各细胞组分的增殖还有赖于一系列紧密联系的生化和分子生物学的级联反应。这些分子机制逐一和递次地出现在皮肤损伤修复的四个阶段,即止血,炎症反应,细胞增殖和塑形,最终实现皮肤创面如期修复愈合;换言之,正是损伤修复相关因子推动了损伤修复的进程。因此,深入认识损伤修复的分子机制,进而采取有效的治疗手段调节修复促进因子的表达和产生具有重要的理论价值和临床意义。同时,对损伤修复促进因子(因素)的上调作用正在成为评价创伤治疗效果的重要指标。长期的临床实践证实,将医用丝光绿蝇蛆虫(简称五谷虫)放置于创面表面可以对创面起到祛腐清创的作用。这一治疗方法尤其适用于感染及坏死较为严重的慢性创面和溃疡的治疗。尽管五谷虫具有吞噬和去除污染及感染组织的作用,但由于主客观的原因并非所有患者都能够接受这种治疗方法;另外,蛆虫短暂的成熟期使它们很快变蛹失去效用。近期研究发现,五谷虫促进创面愈合的作用不仅是通过吞噬感染组织,其分泌和排泄物中也含有一些有益于抗菌和促进细胞生长的生物活性物质。研究发现,五谷虫虫体本身具有很强的自我修复能力,从而进一步说明五谷虫虫体细胞中含有促损伤修复的细胞因子/生长因子,借助有效生物技术提取的虫体蛋白有可能是治疗皮肤创伤尤其是慢性损伤和不愈合创面的潜在生物制剂。不过,目前有关这方面的研究还鲜见报道。如前所述,损伤修复有赖于皮肤组织中各细胞组分的分裂、增殖、游走和新生血管形成,而这些细胞分子生物学现象受到某些生长因子的调控。这些生长因子以协调和互补的方式共同促进损伤愈合的进程,它们包括表皮生长因子/EGF,转化生长因子/TGF家族蛋白,成纤维细胞生长因子/FGF,肝细胞生长因子/HGF和血小板衍生生长因子/PDGF等。进一步的研究表明,这些因子作为分子信号主要通过特定的或由其它蛋白介导的转导通路将信息传递到细胞核内,通过调节诸如c-Myc,Bcl-2,survivin,cyclin D1和VEGF等基因的表达发挥其损伤修复促进作用。大量研究证实,Wnt,STAT3,TGF-beta-Smad2/3,NF-kB和Notch等信号通路参与了损伤修复和组织再生的过程。尽管五谷虫及其提取物的促损伤修复的效果得到证实,但其作用的分子机制尤其是对上述生长因子,信号通路以及通路下游基因表达的影响迄今尚无报道。阐明上述问题将为五谷虫制剂的实际应用提供科学的依据,因此成为本课题的研究目的。五谷虫本身,其分泌/排泄物以及虫体提取物都有一定的损伤修复促进作用,但目前还不清楚哪些组分发挥更大的作用。因此,在相同的动物体内和体外实验条件下观察这些组分的促进损伤修复的功效以及它们对损伤修复相关因子/信号通路的影响能够科学地回答这个问题,也有助于五谷虫提取物的合理使用与配制。这也成为本博士论文的另一个立题依据。材料与方法一.五谷虫样品制备:蛆虫分泌/排泄物:蛆虫经常规处理后收集。20克冰冻蛆体,切成薄片,总蛋白提取,实验动物共设4组(8只/组):组1:凡士林软膏涂抹;组2:分泌/排泄物(Secretion/excretion;S/E);组3:吐后蛆体裂解液(Extract+S/E);组4:未吐蛆体裂解液处理(Extract-S/E)。二.体内实验部分:1.动物选择与饲养条件:取健康成年雄性SD大鼠32只,随机分成4组(8只/组)。饲养于25℃,相对湿度为40%~70%环境下,每天接受自然光照9小时,由饮食饮水。2.损伤模型的建立:麻醉药腹内注射麻醉后,去毛剂脱毛;无菌下在背部造成2个直径为1.5cm的圆形全层皮肤开放创面。造模动物不用抗生素及抗凝剂。3.愈合情况观察:于造模后第1、3、5、7、9、12、14和16天观察创面的色泽、肿胀程度、表面渗液、肉芽组织生长和表皮增生修复情况。用透明膜创面记录表描画创面外缘。4.创面愈合的测定方法:根据透明膜上描记的创面外缘,利用photo shop软件计算创面面积及愈合百分率:面积测算公式:面积=圈内灰度值/标准面积单位灰度值;创面愈合百分率:愈合率=所测面积/初始面积X 100%。5.创面取材和组织学观察:在上述观测期,取各创面0.2X0.4cm全层边缘健康组织,分别做做冰冻切片/蛋白提取和石蜡包埋组织H/E组织形态学染色。显微镜下观察组织中各细胞成分的生长情况、有无坏死。这些组织还将用于细胞和分子生物学分析。根据上述观察,评估各处理方式促进愈合的效果。三.体外实验:1.细胞培养:Ha Cat人角质细胞系;原代培养的人正常成纤维细胞系;2.五谷虫提取物:1空腹五谷虫组(虫体组);2含分泌物五谷虫组;3分泌物组。3.提取物浓度:200mg/ml,150mg/ml和100mg/ml;4.观察时间:72小时5.实验方法:MTT细胞增殖活性测定;划痕损伤实验;RNA提取和RT-PCR;蛋白提取和Western印迹分析。结果第一部分三种五谷虫提取物的制备及产出量和质量分析出不含五谷虫分泌物/排泄物的五谷虫虫体组(20克),含分泌物/排泄物的五谷虫虫体组(20克)和由20克五谷虫分泌和排泄的混合物中的蛋白浓度,它们的含量分别是89.85mg(5.99mg/ml;5990mg/ml),88.05 mg(5.87mg/ml;5870mg/ml)和9 mg(0.6mg/ml;600mg/ml)。1.五谷虫提取物的制备量和浓度:使用280nm的紫外分光光度计测出OD值,计算2.五谷虫提取物组成成分分析:10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示:两组虫体提取物所含蛋白的分子量大小范围从7 k Da到210 k Da,蛋白谱型基本一致,蛋白的条带清晰,无拖尾降解现象但分泌/排泄后虫体提取物的蛋白条带略弱一些;分泌物/排泄物混合物未见大分子蛋白,条带的分子量小于7 k Da。3.采用新方法制备五谷虫提取物缩短了制备时间:采用本文介绍的方法可在不到5分钟即可完成五谷虫粗提物的制备且操作过程十分简捷。4.高浓度五谷虫分泌的收集:采用本文收集方法可获得浓度为600mg/ml甚至更高的混合物,使不经浓缩甚至需稀释后用于体内和体外实验成为可能。第二部分改良的透明膜测量法在计算大鼠皮肤损伤愈合率中的应用1.高通量的信息采集:按观测不同的时间,组别和大鼠编号将所测创面简洁、整齐和有序的(一个创面的不同观察日标记信息―圈套圈‖的形式)集成到本课题设计的一张长方形透明膜上。由于实验末期的一些实验组的创面提前愈合,所以在整个实验过程中总共在一张透明膜上记录和收集了243个而非256个创面边缘描记图像。而传统的透明膜测量方法是按预计观测次数与创面数量准备足够数量的整张面积大于造模面积的正方形透明膜,并在每张透明膜上标明观测时间,组别和大鼠序号。因此,信息采集过程十分繁琐、费时和凌乱。2.透明膜标记信息的精确和高效处理:将含有243个创面边缘描记图像的透明膜经扫描仪扫描入电脑并保存后,利用Adobe Photoshop CS4 site图像分析软件工具栏中磁性套圈选项描记创面边缘,点击直方图项(图2C)查看创面像素值,并将像素值填在excel表中,对每个标记信息的测量平均用时在27秒以内。因此,在2小时之内便可获得所有观测日包(括首日)全部243个创面的像素值和面积。3.改良透明膜测量法有很高的机动性:根据创面随时间推移而逐渐变小的特点,透明膜模板内附有四个标准面积单位作为计算标准尺,所以可根据所需测量创面的大小选择面积合适的计量单位或用同一个计量单位的像素值进行所有创面的面积换算。4.未经分泌/排泄的五谷虫虫体提取物有更强的损伤修复促进作用:对4个实验组8个时间点的243个采集信息的像素/面积换算的结果表明,与只有凡士林处理的创面相比,三种五谷虫提取物均有损伤修复促进作用(P<0.05)且以150mg/ml未经分泌/排泄的五谷虫虫体提取物的实验组创面愈合的速度更快,该组内的所有创面在实验第14或第16天全部愈合。5.Ki-67阳性细胞标记率的差异:Ki-67由G1和S期细胞产生,因此是反映细胞增殖活性的生物标记物。免疫组织化学染色的结果显示,含分泌/排泄物和不含分泌/排泄物的五谷虫虫体提取物处理创面内的Ki-67阳性细胞表达率明显高于凡士林涂抹组创面,进一步提示两种提取物具有细胞增殖促进作用。第三部分五谷虫提取物促进人角质细胞和成纤维细胞增殖1.中低浓度五谷虫提取物的细胞增殖促进作用:使用最终浓度为150mg/ml和100mg/ml的含分泌/排泄物(Extract+S/E)和不含分泌/排泄物(Extract-S/E)的五谷虫虫体提取物处理人永生化角质细胞Ha Cat和10代以内的成纤维细胞。H/E染色和MTT的检测结果显示,两种细胞被100mg/ml和150mg/ml的Extract+S/E和Extract-S/E处理后细胞数目明显增加,增殖活跃。2.高浓度五谷虫提取物具有细胞毒性:当使用200mg/ml的Extract+S/E和Extract-S/E处理Ha Cat和成纤维细胞后,两种细胞出现大量死亡现象,MTT的OD值明显降低,提示五谷虫提取物作为生物活性物质在高浓度下有较强的细胞毒作用。第四部分五谷虫提取物促进体内和体外皮肤损伤修复的分子机制1.五谷虫提取物处理组织中没有发现NF-kB亚单位p65的核易位,即NF-kB处于不活化状态;2.Wnt2在创面组织内表达但b-catenin分布在胞浆尤其是膜表面,未见核易位,提示Wnt2/b-catenin通路没有活化;3.受损组织内Notch1表达水平较低且其下游基因Hes1罕见核易位,故该通路的活性很低;4.基于组织芯片的免疫组织化学染色结果显示,五谷虫提取物能明显上调TGF-b/Smad3和STAT3的表达;在胞浆和细胞核内均可检测到磷酸化STAT3,因此这两个通路在五谷虫提取物处理组织内的活化程度明显提高。5.对五谷虫提取物处理的角质和成纤维细胞的检测结果与创面组织的结果相似,即处理后的两种细胞内,TGF-b/Smad3和STAT3信号通路的活性明显增强而其它几个被测通路的活化状态在提取物处理前后变化不大。6.五谷虫提取物对损伤修复相关基因的上调作用:来自体外培养的两种细胞和组织芯片的检测结果显示,五谷虫提取物能明显上调创面组织,角质细胞和成纤维细胞内c-Myc,cyclin D1 and VEGF的表达,且以Extract+S/E处理组更为明显。而Notch的下游基因Hes1和NF-kB的靶基因COX-2则变化不显著,提示五谷虫提取物不影响Notch和NF-kB信号通路的活化状态。7.五谷虫提取物处理组织内CD68-阳性细胞明显减少:CD68-阳性细胞的多少反映受损创面的炎性反应程度。检测发现,未处理组的第3和第7天创面组织内存在少量CD68-阳性细胞(5-8细胞/视野;X20),而提取物处理组的组织内则极少见到(<2细胞/视野;X20)甚至没有见到CD68-阳性细胞。这说明,实验过程中皮肤创面处于无感染状态,五谷虫提取物能进一步降低炎性反应的程度。结论1.采用本课题组独特的蛋白提取和分泌/排泄物收集方法,高产出,高质量地制备出三种五谷虫提取物,为下一步的实验研究提供了可靠的保证。2.建立和完善了透明膜创面面积标记和测量法并在精确计算大鼠皮肤损伤愈合率中应用,获得了可靠的数据,取得了更为精确的测量结果。3.基于透明膜创面面积标记和测量法的检测结果显示,含有分泌/排泄的,分泌/排泄后的五谷虫虫体提取物以及分泌/排泄混合物对大鼠皮肤损伤均有促进创面愈合的作用且前者的作用更为明显。这提示,在五谷虫虫体及其分泌/排泄混合物中都含有损伤修复促进因子。因此,在实践中使用未经分泌/排泄的虫体提取物可能取得更好的治疗效果。4.中低浓度的五谷虫提取物对人角质细胞和成纤维细胞的增殖有促进作用,但浓度较高时则抑制细胞生长甚至具有杀伤性。这种现象表明,五谷虫提取物具有较强生物活性,因此在使用前应该掌握其最佳使用浓度,以避免可能产生的不良反应。5.对仅用凡士林处理和五谷虫提取物处理创面的检测结果显示,提取物处理对创面组织内NF-?B,Wnt2/?-catenin和Notch通路的状态无明显影响,说明这三个通路未必是提取物作用的对象;换言之,后者对修复的促进作用不是借助这三个通路来实现。6.TGF-?/Smad3通路是公认的损伤修复促进因素而STAT3通路的活化能够上调一系列细胞增殖促进基因的表达。本研究结果显示,五谷虫提取物处理后的大鼠皮肤组织和人角质及成纤维细胞细胞内这两个通路的活化程度明显提高,从而提示上述两个通路的活化在五谷虫提取物促进损伤修复过程中可能发挥重要的作用。7.RNA和蛋白质的检测结果显示,五谷虫提取物处理的组织和细胞中这三个基因的表达明显上调。由于NF-?B,Wnt2/?-catenin,Notch信号转导通路在被检组织和细胞内活化程度较低或处于不活化的状态,而TGF-?/Smad3通路在一定程度上对c-Myc表达有负性调节作用,故认为c-Myc,cyclin D1 and VEGF表达上调很可能是STAT3通路活化的结果。TGF-?/Smad3和STAT3对c-Myc表达的双向调节则提示,两者在多阶段损伤修复过程中可能存在某种互动和功能交替,在生物功效上也许处于动态平衡。这一点有待下一步研究证明。创新性本课题首次采用崭新的创面信息采集和创面面积测算技术评估并证实三种五谷虫提取物对大鼠皮肤损伤修复的促进作用。首次以主要的损伤修复相关信号通路及其下游靶基因作为切入点,以大鼠皮肤创面作为体内模型,人角质细胞和成纤维细胞作为体外实验模型,系统地分析了五谷虫提取物促进损伤修复的分子机制并得出较为肯定的结论。本课题获得的研究结果为五谷虫提取物的高质量制备,科学合理的使用和疗效评价提供了新的理论和实验依据,故有一定的转化医学意义。