本研究以长江流域及以南地区广泛种植的砂梨(Pyrus Pyrifolia Nakai)为研究对象,研究了与梨果实品质密切相关的石细胞、果皮颜色和果实有机酸品质性状,从生理生化、基因克隆、基因表达模式、转基因验证等方面进行了关于砂梨果实发育过程中石细胞、果皮褐色形成机制及砂梨果实柠檬酸积累机制的研究。本研究对砂梨果实石细胞、褐色果皮形成、柠檬酸优势积累的探讨,为砂梨新品种的选择、培育提供了理论基础。本研究获得的主要结果如下：1、梨果实中石细胞研究(1)本研究选取‘桂花’和‘脆绿’两个砂梨品种为研究对象,经分析两者果实的石细胞含量和木质素含量在果实发育期及成熟期均存在显著差异。在果实发育过程中,‘桂花’和‘脆绿’果实中的石细胞和木质素含量均在果实发育初期升高,盛花后56天达到峰值然后下降,盛花后98天后维持在一定的水平,直至果实成熟。在石细胞形成的主要时期(盛花后42-70天),‘桂花’果实中的石细胞和木质素含量均显著高于‘脆绿’,最大差异均在两倍以上。因此,‘桂花’果实中与石细胞形成相关的木质素合成代谢要比‘脆绿’旺盛,相关基因表达可能要强于‘脆绿’。(2)为进一步研究木质素代谢在石细胞形成中的作用,本研究从梨果实中克隆分析了一个木质素代谢途径中的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl CoA reductase; CCR)的编码基因,命名为PpCCRo经分析该基因包含一个1020bp的开放阅读框(ORF),编码339个氨基酸,预测的蛋白质分子量为37.2kDa。生物信息学分析表明,PpCCR与其它植物CCR相比有较高同源性,并且具有保守的NADP结合位点及酶催化位点。系统进化树的分析结果表明,植物CCR家族可分为双子叶植物和单子叶植物两大类,PpCCR属于其中的双子叶植物类,与桉树、杨树、光皮桦等木本植物CCR亲缘关系较近。PpCCR基因在‘桂花’和‘脆绿’果实中的表达模式与果实中石细胞和木质素含量变化趋势相同。并且,在果实石细胞形成主要时期,PpCCR基因在‘桂花’果实中的表达量显著高于‘脆绿’,这表明PpCCR基因的表达与木质素合成及石细胞形成相关。本研究在克隆和分析PpCCR基因的同时,还发现了PpCCRx和PpCCRx2基因,这两个基因与PpCCR相比最大的差异在于比PpCCR基因多出一个282bp的片段,命名为x片段。由于x片段的出现,导致PpCCRx和PpCCRx2基因的编码区在距起始密码156bp处终止,不能正常编码一个CCR基因。在DNA和RNA水平对PpCCR、PpCCRx和PpCCRx2分析表明三者分属不同转录本。(3)采用农杆菌介导的花序浸染法将从梨果实克隆到的PpCCR和PpCCRx基因转入拟南芥进行基因功能分析,结果表明,超表达PpCCR基因影响了拟南芥的生长状况,使植株明显矮化、叶片皱缩、茎木质化加剧,这说明PpCCR基因在木质素合成中行使了正常的功能；而超表达PpCCRx基因后的拟南芥植株与野生型没有显著差异,表明PpCCRx基因在木质化过程中没有行使正常CCR基因的功能。转基因功能验证结果说明,由于x片段的出现,PpCCRx和PpCCRx2基因在梨果实中的功能是冗余的,不能正常参与木质素的合成。(4)本研究从梨基因组中克隆了与木质素合成相关的PpCCR基因的启动子序列,经过在NCBI数据库中比对,没有已知植物的核苷酸序列与其有同源性,说明这是一个较新的、特性未知的启动子。将该启动子连接GUS报告基因转入拟南芥进行分析,结果显示在叶脉中、茎木质部组织中可检测到较强的GUS信号而在野生型中没有检测到,这表明PpCCR基因启动子在木质化的组织有较强的活性。由于转录因子作用于启动子而对基因转录的调控作用,本研究分析了可能作用于PpCCR基因启动子的WRKY转录因子。通过对八个WRKY家族成员分析表明,该家族的WRKY2与PpCCR在转录水平存在相关性,两者的表达模式与石细胞含量变化较相近。WRKY2可能直接或间接作用在PpCCR基因的启动子上,参与调节细胞的木质化,最终影响了梨果实中石细胞的形成。(5)为了明确钙(Ca)和硼(B)两种元素在石细胞形成中的作用,本研究以湘南梨为对象,分别做了树体喷施Ca、B处理,结果表明两种处理没有显著改善‘湘南’梨果实中的石细胞含量。进一步分析果实各组织中Ca含量表明,喷施Ca处理没有影响果皮和果肉中的Ca含量,也没有影响石细胞中的Ca含量。但是,石细胞本身较高的Ca含量表明Ca在石细胞形成过程中有重要作用；喷施B处理后显著提高了果皮和果肉中B含量,但没有显著影响到石细胞中的B含量,说明B在石细胞形成中的作用较小,也可能是没有影响石细胞含量的原因。2.砂梨果皮褐色研究(1)本研究以‘湘南’梨(褐色果皮)及其芽变材料-‘绿皮湘南’(绿色果皮)为试材,探讨了砂梨果实褐皮的形成机制。‘绿皮湘南’经多年观察绿色性状稳定,对成熟果实经MINOLTA CR-300型色差计(日本)分析,其颜色与‘湘南’相比绿色差异极显著。对‘绿皮湘南’成熟果实糖酸品质分析表明,主要的糖和有机酸含量均高于‘湘南’。(2)采用RNA-Seq技术对‘湘南’和‘绿皮湘南’果皮进行转录测序分析,结果表明‘绿皮湘南’果皮中145个基因发生上调表达,84个基因下调表达。对差异基因的Pathway聚类分析结果显示,‘绿皮湘南’果皮中以类黄酮合成途径和苯丙烷合成途径中的基因上调最为明显,其它也包含有脂肪酸代谢及相关途径中的基因上调。脂肪酸代谢及相关代谢途径与果实表面蜡质的形成相关,扫描电镜观察结果显示‘绿皮湘南’果皮表面积累了一层完整的蜡质,而‘湘南’果实表面粗糙、没有蜡质层。由此可见,‘绿皮湘南’表面蜡质保护了果实表皮细胞的完整性,也许是果实可以清晰呈现叶绿素的颜色,导致果皮绿色的直接原因；而类黄酮和苯丙烷类代谢均属次生代谢,其代谢旺盛可能与突变体果皮呈绿色,果实自身光合作用较强、碳水化合物转化能力较强有关,这是突变的下游结果而不是突变的原因。3.梨果实柠檬酸代谢研究(1)‘雁荡雪梨’是一个以柠檬酸为主要有机酸的砂梨品种,而‘梗头青’是以苹果酸为主的品种。对‘雁荡雪梨’和‘梗头青’的可滴定酸分析表明,两者可滴定酸含量都呈现发育初期升高,后一直降低至成熟的趋势,但‘雁荡雪梨’果实酸含量在盛花后42天后一直高于‘梗头青’。对两个品种果实的主要有机酸含量分析表明,柠檬酸积累主要在盛花后70-154天,苹果酸积累主要在盛花后42-112天。由于果实发育后期柠檬酸在‘雁荡雪梨’中大量积累而‘梗头青’中积累较少,导致前者成熟果实中的有机酸以柠檬酸为主,而梗头青以苹果酸为主。(2)为了明确有机酸代谢相关酶在‘雁荡雪梨’果实柠檬酸积累过程中的作用,本研究分析了五个有机酸代谢相关酶CS、ACO、NADP-IDH、NAD-MDH和NADP-ME的活性,并对相应的编码基因Pp:mtCs、Pp:cyAco、Pp:cyldh、Pp:mtMdh和Pp:cyMe进行了表达模式分析。结果表明这五个有机酸代谢相关酶在基因转录、酶活变化及柠檬酸积累之间没有严格的对应关系。对三个贮藏相关基因Pp.vVAtpl、Pp:vVAtp2(编码V-ATPase)和Pp:vVpp(编码V-VPPase)进行转录水平的分析表明,三者在‘雁荡雪梨’果实发育后期上调表达,而同时期在‘梗头青’中下调表达,这种表达模式可能与‘雁荡雪梨’果实中的柠檬酸优势积累相关。