论文部分内容阅读
目的:我国是乙肝大国,每年有许多患者发展成肝硬化甚至门脉高压,而门脉高压导致的各种并发症,如肝肾综合征、肝肺综合征等,也会显著增加患者的死亡率。目前对肝硬化门脉高压及其各种并发症的病理生理机制的认识还未完全清楚,治疗效果也不满意。因而探讨肝硬化门脉高压及其各种并发症的发生机理,以寻求干预途径和方法势在必行。以往研究发现,一氧化氮(nitric oxide,NO),作为一种血管扩张物质,在肝硬化外周血管扩张和高动力循环的发生、发展中起着重要的作用,在肝肾综合征和肝肺综合征的发病中也起着一定的作用。内源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)是血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的降解产物,作为体内一种重要的气体信使分子,在很多方面和NO相似,参与体内的多种病理生理过程。我们以前的实验发现,HO-CO系统在肝纤维化大鼠模型的肝脏中表达增加,并对肝脏起着保护性作用。目前对于HO-CO系统的研究主要集中在肝细胞的保护和抗炎作用,对其在肝硬化门脉高压阶段所起的作用,是保护肝脏还是加重肝细胞损害,国内外报道的文献很少;在肝外组织器官的研究多集中在单一脏器,缺乏多脏器系统全面的研究,HO-1在肝外器官,如肾脏、肺脏中的表达是否具有组织差异性,以及HO-1在这些脏器中的作用机制如何,目前仍然不清楚;此外,针对肝硬化及并发症的相应干预治疗的研究较少,而且缺乏在疾病不同阶段对该系统变化及作用的认识。本研究的目的就是探讨在肝硬化门脉高压阶段,HO-1在肝脏、肾脏、肺脏中的表达与这些脏器结构、功能改变之间的关系,通过给予HO-1的诱导剂和抑制剂来调控HO-1的活性,揭示其在各脏器中的作用,为寻找治疗肝硬化及门脉高压并发症的方法提供理论基础。
本研究共分三部分。
第一部分 HO-1在肝硬化门脉高压大鼠肝脏中的表达及意义
第二部分 HO-1在肝肾综合征大鼠模型肾脏中的表达及对肾脏病理和肾功能的影响
第三部分 HO-1在肝肺综合征大鼠模型肺脏中的表达及对肺血管和肺功能的影响
方法:取健康雄性SD大鼠44只,随机分成4组:假手术(SH)组8只、肝硬化门脉高压(PH)组12只、锌原卟啉(ZnPP)组12只、钴原卟啉(CoPP)组12只。PH组应用胆总管结扎的方法制备肝硬化门脉高压大鼠模型,4周后模型形成取材。ZnPP组和CoPP组制模方法同PH组,取材24小时前分别给予ZnPP或CoPP腹腔注射一次,PH组给予等量的生理盐水腹腔注射。所有大鼠最后24小时在生物笼中收集尿量,检测尿肌酐、尿钠;生物机能实验仪测定大鼠的门静脉压力、平均动脉压,超声测量肾动脉血流量,检测动脉血气,之后将大鼠处死,采集静脉血;取肝、肾和肺组织。通过免疫组织化学的方法观察大鼠肝脏、肾脏和肺脏HO-1蛋白的表达:Western-blot方法测定上述脏器HO-1蛋白的表达;RT-PCR的方法检测大鼠上述脏器HO-1 mRNA的水平。HE染色观察肝脏、肾脏、肺脏的结构改变;血气分析检测动脉血中碳氧血红蛋白(carboxyhemoglobin,COHb)的浓度及肺泡—动脉氧分压差(A-aPO2);采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)反映肝脏功能;肌酐清除率、血钠和尿钠浓度反映肾功能;A-aPO2反映肺功能变化。
结果:1、肝硬化门脉高压大鼠模型复制成功
(1)PH组大鼠毛色蓬乱而不光滑,精神萎靡,食欲不振,活动减少,尿色黄,便色浅,腹部膨隆;解剖腹腔内见大量腹水;
(2)血清生化指标AST测定结果显示:与SH组相比,PH组明显升高(209.11±45.77 U/L vs156.8±18.28 IU/L,P＜0.05);
(3)与SH组相比,PH组的门静脉压力显著升高(15.56±2.36 mmHg vs9.24±0.76 mmHg,P＜0.01);
(4)与SH组相比,PH组的平均动脉压力显著降低(59.23±12.19 mmHg vs118.83±8.09 mmHg,P＜0.01);
(5)HE染色结果显示PH组大鼠肝脏细胞桥样坏死,肝细胞结节样再生,肝小叶结构紊乱、破坏,汇管区见大量炎性细胞浸润,假小叶形成。
2、HO-1在肝硬化门脉高压大鼠肝脏中的表达及意义
(1)与SH组相比,免疫组织化学方法、Western-blot方法及RT-PCR方法显示PH组肝脏HO-1表达增加(P＜0.05)；
(2)与PH组相比,ZnPP组肝脏HO-1表达减少,动脉血COHb降低(0.23±0.06％ vs0.50±0.20%,P＜0.05),血清AST水平下降(176.4±32.15IU/L vs209.11±45.77 IU/L,P＜0.05),但仍高于正常组;大鼠肝脏HE染色显示,ZnPP组汇管区及中央静脉周围炎性细胞浸润较PH组明显减少;
(3)与PH组相比,CoPP组肝脏HO-1表达进一步增加;动脉血COHb进一步增加(0.83±0.39% vs0.50±0.20%,P＜0.01);血清AST水平进一步升高(311.6±60.65IU/L vs209.11±45.77 IU/L,P＜0.05);大鼠肝脏HE染色显示,CoPP组汇管区及中央静脉周围炎性细胞浸润较PH组明显增加。
3、HO-1在肝硬化门脉高压大鼠肾脏中的表达及意义
(1)与SH组相比,PH组肾脏HO-1表达减少；24小时总尿量降低(10.93±1.92ml/24 h vs15.00±2.23 ml/24 h,P＜0.05);肾动脉血流量显著下降(3.58±0.04ml/min·100g vs142.86±3.44ml/min·100g,P＜0.05)、血钠浓度下降(138.75±0.96mmol/L vs142.86±3.44 mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率显著降低(0.12±0.05 ml/min vs0.23±0.02 ml/min,P＜0.05);而肾脏病理显示除了血管扩张和肾间质充血,未发现明显的肾脏病理改变;
(2)与PH组相比,ZnPP组肾脏HO-1表达进一步减少;肾动脉血流量进一步降低(3.50±0.08ml/min·100g vs3.58±0.04 ml/min·100g,P＜0.05);24小时总尿量进一步降低(8.50±1.10 ml/24 h vs10.93±1.92 ml/24 h,P＜0.05);血钠浓度进一步降低(136.57±1.40 mmol/L vs138.75±0.96 mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率进一步下降(0.07±0.01 ml/min vs0.12±0.05 ml/min,P＜0.05);门静脉压力和平均动脉压力无显著变化;
(3)与PH组相比,CoPP组肾脏HO-1表达显著增加;肾动脉血流量显著增加(3.76±0.06 ml/min·100g vs3.58±0.04 ml/min·100g,P＜0.05);24小时总尿量显著升高(13.5±1.10ml/24h vs10.93±1.92 ml/24 h,P＜0.05);血钠浓度显著增加(142.64±5.43 mmol/L vs138.75±0.96mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率略增加(0.14±0.04ml/min vs0.12±0.05 ml/min,P＞0.05);门静脉压力和平均动脉压力无显著变化。
4、HO-1在肝硬化门脉高压大鼠肺脏中的表达及意义
(1)与SH组相比,PH组肺脏HO-1表达增加;动脉血COHb增加(0.50±0.20% vs0.23±0.05,P＜0.01);A-aPO2增加(13.99±2.09 mmHg vs7.72±3.67 mmHg,P＜0.05);肺脏病理显示肺内血管扩张;
(2)与PH组相比,ZnPP组肺脏HO-1表达减少;动脉血COHb降低(0.23±0.06% vs0.50±0.20%,P＜0.05);A-aPO2略降低(11.33±2.44 mmHg vs13.99±2.09 mmHg,P＞0.05),但仍高于正常组;肺脏病理显示肺内血管扩张程度减轻;门静脉压力和平均动脉压力无显著变化;
(3)与PH组相比,CoPP组HO-1表达进一步增加;动脉血COHb进一步增加(0.83±0.39% vs0.50±0.20%,P＜0.01);A-aPO2进一步增加(19.56±7.39 mmHg vs13.99±2.09 mmHg,P＜0.05);肺脏病理显示肺内血管扩张更加明显;门静脉压力和平均动脉压力无显著变化。
结论:
1、胆管结扎方法可成功制备肝硬化门脉高压大鼠模型和肝肾综合征、肝肺综合征大鼠模型。
2、在肝硬化门脉高压阶段,HO-1在各脏器表达不同,具有组织差异性。HO-1在肝脏、肺脏中表达增加,而在肾脏中表达减少。
3、在肝硬化门脉高压阶段肝脏HO-1过度表达加重肝细胞损伤,促进门脉高压高血流动力循环变化,加速肝硬化形成。
4、肝硬化门脉高压大鼠肾脏HO-1表达减少是实验性肝肾综合征发病的一个重要原因。
5、肝硬化门脉高压大鼠肺脏HO-1表达增加是实验性肝肺综合征发病的一个重要原因。