论文部分内容阅读
目的:探讨骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)定向诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,采用全骨髓培养法获取骨髓基质细胞。体外进行诱导:改换培养基为含bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L以及2%B27的DMEM/F12培养72小时,观察细胞形态变化,一部分检测Nestin标志物;另一部分在含bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L、2%B27及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12继续培养96小时,检测GAD67。癫痫模型的制作:腹腔注射氯化锂3mEq/kg,18-20小时后皮下给匹罗卡品30mg/kg,在注射匹罗卡品30min前注射甲基东莨菪碱1mg/kg。观察大鼠行为变化,急性期观察到癫痫持续状态认为造模成功,采用Racine癫痫分级标准,Racine5级被定为癫痫持续状态;慢性期观察到癫痫自发性发作,2W后可认为造模成功。最后脑立体定位仪定位海马,将在体外培养好的骨髓基质细胞来源的神经干细胞调节体系移植入癫痫大鼠海马内,移植后观察大鼠行为变化,分别在2W、4W时心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的迁移、分化情况。结果:骨髓基质细胞传至四代,免疫细胞化学鉴定纯度达99%,诱导72小时后,细胞涂片检测Nestin表达阳性,继续诱导96小时GAD67检测约60%阳性。约60%大鼠在注射匹罗卡品30min内观察到典型癫痫发作,采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15～20%的动物造模成功。骨髓源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论:骨髓基质来源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。