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目的:建立小鼠角膜缝线、前房植入生长因子bFGF和同种异体角膜移植动物模型,检测不同动物模型角膜新生血管和新生淋巴管的生长情况,检测虹膜睫状体血管以及与淋巴管相关因素的变化情况。方法:一、建立小鼠不同种方法的角膜新生血管动物模型1、角膜缝线法选取BALB/c小鼠32只,腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪麻醉后,首先用直径2mm的角膜环钻在小鼠角膜中央轻压作角膜压痕,用11-0尼龙线垂直压痕方向做角膜缝线。2、前房植入碱性成纤维生长因子bFGF将22只BALB/c小鼠随机分为两组,A组前房植入空白载体,B组前房植入bFGF 80ng。麻醉成功后,用尖刀片于周边部角膜作板层角膜切口,穿透前房,将含有生长因子bFGF的缓释药及空白载体植入下方前房角,11-0尼龙线缝合角膜切口。3、同种异体角膜移植手术对22只BALB/c小鼠行右眼同种异体穿透性角膜移植术,供体角膜来自于C57BL/6小鼠。二、免疫荧光和组织病理学对角膜及虹膜的检测各组小鼠于术后3、5、7、14天分别取2～4只眼球,制作眼球冰冻切片、角膜铺片、虹膜铺片,应用LYVE-1、CD31和CD11b进行免疫荧光染色,观察角膜血管和淋巴管的生长情况和虹膜血管以及与淋巴管相关因素的变化情况。术后7天取眼球做石蜡切片HE染色,组织病理学检测。三、分子生物学检测角膜及虹膜VEGFR-3、VEGF-A、VEGF-C的表达提取角膜缝线法术后7天、14天和正常角膜及虹膜mRNA,RT-PCR方法检测与淋巴管相关的生长因子及受体VEGFR-3、VEGF-A、VEGF-C的表达情况。四、角膜新生血管和淋巴管组织超微结构的观察缝线法及角膜微囊法诱导角膜新生血管化小鼠术后5天,14天各3只,行透射电镜检查,观察不同时间角膜血管和淋巴管的超微结构。结果:1、裂隙灯观察动物模型新生血管的生长情况(1)缝线组:术后第1天角膜缘血管充血。术后3天新生血管呈弧形或袢状侵入角膜。术后5天新生血管垂直于角膜缘密集伸入角膜。术后7天,血管进一步生长,长入缝线处。术后7天拆除缝线,新生血管逐渐消退,至术后14天仅残留少量血管影。(2)前房植入生长因子bFGF组:术后第1天角膜水肿,可见淡黄色透明缓释载体位于下方前房内虹膜的前方。术后3天角膜水肿、基质增厚,可见新生血管生长,虹膜血管怒张。术后5天大量新生血管垂直于角膜缘密集长入角膜。术后7天,血管进一步生长。术后14天血管变细消退,仅残留少量血管影,前房缓释载体变小。(3)同种异体角膜移植组:术后3天角膜植片轻度水肿,角巩缘新生血管怒张,少量新生血管伸入植床边缘。术后7天角膜植片水肿、混浊,新生血管长入植床,部分到达植片。拆除角膜缝线后,新生血管迅速消退。术后14天,角膜植片仍保持透明,3~4周开始出现排斥反应。2、免疫组织化学检查(1)角膜缝线组:术后3天血管开始生长,7天生长旺盛,14天消退。角膜铺片观察正常角膜仅在角膜缘处可以看到CD31+血管网呈袢状分布,少量LYVE-1+淋巴管以膨大的盲端出现于角膜缘。缝线术后7天,可见大量血管呈树枝状垂直角膜缘方向长入角膜,血管密集,末端尖锐矛刺状。LYVE-1+淋巴管伴随血管呈火焰状深入角膜中央,以盲端结束,管腔粗,形态不规则,角膜基质内可见散在的LYVE-1弱阳性树枝状细胞。缝线术后14天,血管明显变细,末端吻合成血管袢。淋巴管也变细变短,末端钝圆,部分淋巴管与角膜缘淋巴管断开,形成孤立于角膜基质中的短小管状结构,周围基质内可见散在的LYVE-1阳性树枝状细胞,为CD11b阳性。虹膜铺片可见正常虹膜内放射状排列的虹膜血管;缝线术后7天血管密度增加,管腔明显增粗,血管内皮细胞间隙增宽。正常虹膜组织内存在少量LYVE-1阳性的、形态如树枝状的细胞,多集中分布于虹膜瞳孔缘,而缝线术后及角膜微囊袋术后7天,该类细胞的数量明显增多,散在分布于虹膜睫状体内,虹膜中外及睫状体侧密度较高。双重免疫荧光染色显示为CD11b阳性、F4/80阳性,为骨髓来源的巨噬细胞中的一部分。(2)前房植入生长因子bFGF组:术后7天,眼球冰冻切片可见角膜增厚明显,角膜全层大量CD31阳性血管表达,浅中层基质内可见角膜淋巴管生长;虹膜增生肥厚,大量血管表达,虹膜晶状体面可见较多的LYVE-1阳性细胞,沿虹膜色素上皮表面分布,延续至睫状体。虹膜铺片见大量的LYVE-1阳性细胞,形态不规则,散在填充于虹膜血管周围间隙内,未见明显的管状结构,未见LYVE-1阳性淋巴管。(3)同种异体角膜移植组:角膜铺片PKP术后3天,周边可见袢状和毛刺状的血管及淋巴管,管腔均较粗。术后7天,可见大量的血管及淋巴管阳性表达,部分区域已经达到角膜植片。CD11b染色显示角膜基质中两种形态的细胞浸润,一种为树枝状的巨噬细胞,另一种为圆型的炎症细胞。淋巴管周围亦可见LYVE-1阳性巨噬细胞。术后14天,血管的数量和密度大大降低,管腔变细。淋巴管消退较慢,末端变钝圆。CD11b+细胞较前明显减少。虹膜铺片PKP术后3天,血管增粗,密度增加,LYVE-1+细胞几乎消失。CD11b染色可见虹膜表面大量圆型炎细胞浸润,树枝形态细胞少见。术后7天虹膜血管粗大,走形僵直。LYVE-1+细胞有所增加,形态不规则,可见小椭圆形细胞,也可见树枝状细胞。圆形CD11b阳性细胞减少,巨噬细胞则较前增多。术后14天,虹膜血管变细,稀疏,LYVE-1+细胞数量较前明显增加,形态以树枝状为多。可见大量CD11b阳性巨噬细胞均匀分布于虹膜内。3、RT-PCR检测缝线术后角膜及虹膜中各因子的变化情况结果显示,角膜和虹膜中的VEGFR-3在缝线术后7天表达上调,并且角膜和虹膜中的生长因子VEGF-A和VEGF-C在术后不同时间的变化趋势一致。4、角膜新生血管和淋巴管组织超微结构的观察淋巴管的腔较大,管壁不规则,由连续的单层内皮细胞围成。内皮细胞除核周区以外,其余部分的胞质都很薄,为连续型,无窗孔,外无周细胞和无基膜或有很少量断续的基膜,偶见于内皮细胞连接处。淋巴管内皮细胞的连接有3种类型,即端端连接、重叠连接和嵌插连接。结论:角膜缝线法、前房植入生长因子bFGF和同种异体角膜移植均可用于建立角膜新生血管和淋巴管生长的动物模型。角膜新生血管和新生淋巴管的生长与消退存在着不同的机理。不同角膜新生血管和淋巴管动物模型虹膜LYVE-1阳性巨噬细胞数量和分布发生改变,未见虹膜淋巴管的生长。角膜移植术后虹膜中CD11b阳性、LYVE-1阳性巨噬细胞早期发生迁移,随后由其他部位的细胞所补充。