一、研究目的及意义随着医学的发展,生物治疗已成为当今恶性肿瘤治疗的主要方向和潮流,其中的基因治疗受到关注。国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。但由于存在基因转染效率较低、靶向性不足,如何增强基因治疗系统对肿瘤的杀伤力就显得极为迫切。肿瘤自杀基因疗法存在旁杀伤效应的显著特点,即转染自杀基因的阳性细胞对周围未转染的阴性细胞的杀伤效应,使自杀基因疗法有更大的应用优势,但单独自杀基因治疗恶性肿瘤仍不能取得治愈的理想疗效,增强旁杀伤效应成为提高其疗效的重要策略。前期研究表明：一些中药成分能通过缝隙连接和／或细胞凋亡机制增强旁观者效应,从而对自杀基因系统有协同增效作用。为了获得更多明确有效的中药成分,以期组成复方并以多种机制协同自杀基因系统,取得更大肿瘤治疗效应,本实验研究进一步筛选了部分已知有一定抗肿瘤效应的中药成分,体外初步明确薯蓣的主要有效成分(金刚藤和知母当中也含有)—薯蓣皂苷元对自杀基因系统的协同杀伤作用,进一步探讨其是否通过GJIC或细胞凋亡机制增强自杀基因旁杀伤效应,阐明其增效的机理,并且体内实验探讨其联合自杀基因系统的疗效。为建立肿瘤基因治疗联合中医药疗法,推进肿瘤基因治疗的临床应用和抗肿瘤中药新药开发提供实验依据。二、研究方法：1.薯蓣皂苷元(Dio)和菝契皂苷元(Sar)对肿瘤细胞的抑制作用：用终浓度0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的Dio分别作用于CBRH7919和B16细胞72h；用终浓度50μM的Dio分别作用于CBRH7919和B16细胞24h,48h,72h,96h；用终浓度0μM、25μM、50μM、100μM、200μM的Sar作用于CBRH7919细胞72h；MTT法检测各组细胞抑制率。2.薯蓣皂苷元(Dio)和菝契皂苷元(Sar)对肿瘤细胞10%tk／GCV系统的协同杀伤效应：把90%CBRH7919(B16)细胞和10%CBRH7919tk(B16tk)细胞混合以后,用终浓度5μM、10μM、20μM、40μM的Dio与终浓度15.7μM的GCV分别作用及联合作用于CBRH7919和B16混合细胞72h；用终浓度25μM、50μM、100μM、200μM的Sar与终浓度为15.7μM的GCV联合作用于CBRH7919混合细胞72h；MTT法检测各组细胞抑制率,比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,金正均Q值分析药物与tk／GCV系统联合作用是否具有协同性。3.薯蓣皂苷元(Dio)对tk／GCV系统协同杀伤作用的机制研究：(1)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞凋亡诱导作用的研究：用终浓度12.5μM、25μM、50μM的Dio分别作用于CBRH7919和B16细胞72小时,荧光染料细胞核染色法观察药物作用后细胞核形态。同样处理的CBRH7919和B16细胞进行彗星电泳,通过测量彗星头部细胞核光密度和尾距,检测药物对细胞核DNA的影响。(2)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞周期和凋亡指数的影响：用终浓25μM、50μM的Dio与终浓度15.7μM的GCV分别联合作用于CBRH7919和B16细胞10%tk／GCV系统72h。流式细胞技术分析各组细胞周期和凋亡指数。(3)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞GJIC的影响：1)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞GJ功能的影响：终浓度12.5μM、25μM、50μM的Dio分别作用于CBRH7919和B16细胞24h以上,待细胞基本融合,荧光染料传输技术(降落伞实验),荧光显微镜下观察染料传输距离。终浓度0μM、12.5μM、25μM、50μM的Dio、终浓度15.7μM的GCV和终浓度15μM的甘草次酸(GA)联合作用于CBRH7919细胞10%tk混合细胞,分别设定Dio组、Dio联合tk／GCV组,Dio联合tk／GCV的基础上联合GA组,药物作用72h,MTT法检测各组细胞抑制率,观察GJ长效抑制剂GA对Dio联合tk／GCV系统对CBRH7919杀伤作用的影响。2)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞缝隙连接蛋白Cx43的影响：用终浓度0μM、25μM、50μM的Dio分别作用于CBRH7919和B16细胞72小时,RT-PCR法检测Dio对CBRH7919和B16细胞Cx43 mRNA的影响；同样方法处理两种细胞株,Western Blot检测Dio对CBRH7919和B16细胞Cx43蛋白表达的影响；所得样本条带光密度和相应的内参比较,计算相对表达量。4.体内动物实验探讨薯蓣皂苷元(Dio)对tk／GCV系统的增效作用：SPF级健康C57BL／6J小鼠,雌雄各半。每只小鼠右前肢皮下接种2×105个肿瘤细胞(含20%B16tk细胞)。随机分组,分别设定模型组、GCV组、Dio组、Dio联合tk／GCV组。接种第1天每日腹腔注射给药Dio 100mg／kg·d,给药第四天发现Dio毒副作用很大,给药浓度减为50mg／kg·d。接种第7天,腹腔注射给药GCV 100mg／kg·d。接种后每日称量体重并记录。当腋下触及肿块,游标卡尺测量肿瘤体积。接种后第十四天实验结束,脱颈椎处死动物,钝性剥离肿瘤,电子天平称瘤块重量。计算抑瘤率。三、研究结果1.薯蓣皂苷元(Dio)和菝契皂苷元(Sar)对肿瘤细胞的抑制作用：：MTT结果显示Dio浓度分别为6.25μM、12.50μM、25.0μM、50.0μM作用于CBRH791972h抑制率分别为：7.65±0.94%、8.53±1.57%、22.31±7.81%、77.85±2.88%;IC50为34.90μM.。作用于B16细胞抑制率分别为：2.40±4.38%、14.67±9.13%、46.60±1.8%、96.61±0.86%.IC50为20.98μM.。提示,Dio对CBRH7919和B16细胞有明显的抑制作用。Sar25μM、50μM、100μM、200μM作用于CBRH791972h抑制率分别为：7.45±5.28%、14.35±3.05%、28.95±4.56%、57.40±2.62%；IC50为239.91μM.。提示Sar对CBRH7919细胞有一定的抑制作用。但IC50较高。Dio浓度50.0μM分别作用于CBRH7919和B16细胞24h、48h、72h、96h对CBRH7919抑制率分别为：26.3±10.0%、66.1±7.5%、84.8±0.7%、88.90±3.10%;对B16细胞抑制率分别为：28.79±5.0%、68.04±6.79%、80.22±4.24%、86.86±1.3%.说明Dio对CBRH7919和B16细胞的抑制作用有明显的时间依赖关系。2.薯蓣皂苷元(Dio)和菝契皂苷元(Sar)对肿瘤细胞10%tk／GCV系统的协同杀伤效应：Dio5μM、10μM、20μM、40μM联合10%tk／GCV组对CBRH7919的实际抑制率(35.56%、38.46%、40.62%、69.3%)显著高于理论抑制率(17.00%、19.67%、23.80%、42.74%),金正钧Q值分别为2.09、1.95、1.70、1.62,均大于1.15,有协同增效作用；Dio5μM、10μM、20μM、40μM对B16细胞10%tk／GCV组的实际抑制率(23.49%、32.60%、39.92%、60.04%)显著高于理论抑制率(16.00%、18.87%、25.19%、34.1%),金正钧Q值分别为1.46、1.72、1.59、1.76,均大于1.15,有协同增效作用。Sar 25μM、50μM、100μM、200μM联合10%tk／GCV组的实际抑制率(-1.68%、22.86%、42.50%、64.88%)不完全高于理论抑制率(23.16%、27.73%、34.47%、57.12%),金正钧Q值分别为0、1.48、1.04、0.91,只有一个浓度大于1.15,具有协同增效作用。3.薯蓣皂苷元(Dio)对tk／GCV系统协同杀伤作用的机制研究：(1)肿瘤细胞凋亡诱导作用的研究：荧光染料细胞核染色结果显示,药物作用后特别是50gM组,细胞核固缩,出现多核细胞,可见凋亡小体。提示Dio可以诱导CBRH7919和B16细胞凋亡。彗星电泳结果显示,药物作用后,细胞核电泳形成明显的拖尾,细胞核光密度降低,并且差异有统计学意义(P＜0.01)。(2)薯蓣皂苷元(Dio)及联合tk／GCV组对肿瘤细胞周期和凋亡指数的影响：流式细胞术结果显示Dio对CBRH7919和B16细胞都显示了G2-M期阻滞,CBRH7919细胞还有S期阻滞,B16细胞S期阻滞不明显。凋亡指数：Dio和tk／GCV联合组均明显大于对照组及单独tk／GCV组,提示有协同杀伤效应。(3)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞GJIC的影响：1)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞GJ功能的影响：降落伞实验结果显示,CBRH7919和B16细胞对照组基本无荧光染料传输,Dio12.5μM、25μM、50μM作用于细胞后,荧光传输距离随浓度加大而增加,呈浓度依赖关系。提示：Dio可以增强细胞GJ功能。加GJ长效抑制剂甘草次酸(GA)后结果显示：Dio联合tk／GCV组在GA阻断后细胞抑制率(33.16%、41.1%、93.84%)与GA阻断前(52.45%、54.76%、98.31%)相比Dio12.5μM、25μM组联合tk／GCV组抑制率明显降低(P＜0.01)。Dio50μM组单独作用己基本死亡,加入GA后抑制率有所下降,但无统计学意义。结果提示：Dio增强旁杀伤效应与缝隙连接机制有关。2)薯蓣皂苷元(Dio)对肿瘤细胞缝隙连接蛋白Cx43的影响：RT-PCR结果显示,作用于CBRH7919：对照组、Dio12.5、25、50μM组相对表达量分别为：0.71、0.83、0.90、0.55。表明Dio12.5μM、25μM对CBRH7919Cx43 mRNA的表达有一定促进作用,Dio50μM表达量降低,可能是高浓度药物对Cx43 mRNA的表达有抑制作用,也可能是多数细胞已死亡。作用于B16：对照组、Dio12.5、25、50μM相对表达量分别为1.10、0.78、1.18、0.86。表明Dio12.5μM对B16 Cx43 mRNA的表达有抑制作用,Dio25μM对B16Cx43 mRNA的表达有促进作用,Dio50μM表达量降低,可能是对Cx43 mRNA的表达有抑制作用,也可能是多数细胞已死亡。Western Blot结果显示：Cx43蛋白的相对表达量,作用于CBRH7919,对照组、Dio 25、50μM分别为：0.47、0.33、0.56。表明Dio25μM对CBRH7919Cx43蛋白表达有抑制作用,Dio50μM对Cx43蛋白表达有促进作用。作用于B16：对照、Dio 12.525、50μM分别为0.71、0.88、1.06、0.70。表明Dio12.5、Dio25μM对B16细胞Cx43蛋白表达有明显促进作用,Dio50μM表达量稍弱,对Cx43蛋白的表达无影响。4.体内动物实验结果表明薯蓣皂苷元(Dio)对tk／GCV自杀基因系统增效作用：肿瘤体积检测结果提示：模型组肿瘤生长速度较快,各治疗组肿瘤体积均明显小于模型组,提示各治疗组有明显抑瘤作用。对于雄性小鼠,Dio组及Dio联合GCV组肿瘤体积明显小于tk／GCV组,Dio联合tk／GCV组肿瘤体积明显小于Dio组。雌性小鼠,Dio组及Dio联合tk／GCV组肿瘤体积明显小于tk／GCV组,Dio联合GCV组肿瘤体积与Dio组无差异。瘤块称重各组间比较显示,各治疗组瘤块重量均明显小于模型组,tk／GCV组与模型组比较,差异无统计学意义。Dio组及Dio联合tk／GCV组瘤块重量与模型组比较,差异有统计学意义(p＜0.05),Dio组及Dio联合tk／GCV组与tk／GCV组比较,差异有统计学意义(p＜0.05),Dio组与Dio联合tk／GCV组比较,差异无统计学意义。tk／GCV组、Dio组、Dio联合tk／GCV组抑瘤率分别为：38.97%、56.84%、61.27%。雄性小鼠与雌性小鼠有明显差异,从肿瘤重量和抑瘤率,Dio联合tk／GCV组的重量明显比各组都小,抑瘤率高,雌性小鼠Dio联合tk／GCV组效果不明显。结果显示,Dio有一定的抑瘤作用,Dio联合tk／GCV以后,抑瘤作用更明显,也从体内实验证实了薯蓣皂苷元联合tk／GCV系统的旁观者效应。体重结果提示,肿瘤对动物体重影响不明显,薯蓣皂苷元和GCV都有一定的毒副作用,薯蓣皂苷元联合GCV后毒副作用有所加强。四、结论薯蓣皂苷元对自杀基因tk／GCV系统杀伤CBRH7919和B16有协同增效作用,其增效作用与缝隙连接机制有关；体内实验结果表明薯蓣皂苷元联合tk／GCV自杀基因系统对小鼠恶性黑色素瘤移植瘤的抑瘤效应比单独薯蓣皂苷元或单独自杀基因系统的抑瘤效应更强。研究表明薯蓣皂苷元可能是通过提高Cx43表达增强GJIC功能从而提高旁杀伤效应而达到协同增效作用。