研究背景与目的:肺癌是全球性的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在我国以及世界其它地区的肿瘤性疾病中均居第一位,严重危害人们的健康和生命。因此,深入研究肺癌发生的分子机制,尤其是癌前病变的分子机制,对于开展高危人群的筛选和利用有效的分子生物标记进行早期诊断,降低肺癌发生率和死亡率具有十分重要的意义。肺癌的发生是一个多阶段、多步骤的过程。例如:肺鳞癌由支气管粘膜上皮恶变所经历的病变包括:增生→鳞状上皮化生→轻度、中度、重度不典型增生→原位癌→浸润癌。既往的研究表明,在肺癌发生过程中需要一系列的遗传学改变的积累,包括DNA突变、缺失、扩增、重组、染色体畸变等引起的基因表达的改变。近年来,人们逐渐认识到基因表达调控的另一重要机制—DNA甲基化,在肺癌的发生发展过程中也起着重要的作用,但是相关的研究还不够深入。DNA甲基化是表遗传学修饰的主要形式,其主要特点是通过对CpG序列的胞嘧啶进行甲基化修饰来调控基因的表达,而DNA序列本身并不改变。已有的研究表明,DNA异常甲基化是人类肿瘤组织中常见的改变之一。一方面,基因组范围内散发的CpG二核苷酸序列普遍发生低甲基化,从而导致染色体的断裂、易位、丢失、以及部分原癌基因的激活;另一方面,抑癌基因的启动子区域CpG岛DNA发生高甲基化,造成相关基因的表达失活。目前,已有较多文献报道肺癌肿瘤组织和细胞株中许多肿瘤相关基因启动子区发生了高甲基化,这些基因涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复、细胞黏附等多条信号通道。可见,在肺癌的发生发展过程中,以DNA甲基化为主的表遗传学机制与遗传学机制占有同等重要的地位。但是,对肺癌癌前组织中DNA甲基化的研究相对较少,DNA异常甲基化在癌前病变中的作用机制也还不清楚。研究表明, 3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene, MCA)和二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine, DEN)诱导的大鼠肺鳞癌的发生与人类肺癌的发生经历了相似的形态学过程,在分子生物学水平上,也都有相似的变化,并导致相似的基因表达的改变。上述研究为利用此肺癌模型探讨人类肺癌发生的表遗传学机制提供了依据。基于以上考虑,我们以致癌物MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌模型为基础,研究癌变过程中DNA甲基化的动态改变情况及作用机制,包括全基因组低甲基化动态变化趋势、各种肿瘤相关基因甲基化状态的改变及对蛋白表达的影响以及DNA甲基转移酶的改变情况等,初步揭示DNA甲基化在化学致癌过程中的作用,为阐明肺癌癌变的表遗传学机制奠定基础。材料和方法:1. Wistar大鼠90只,雌雄各半,6周龄,体重200g±20g,随机分为实验组80只,对照组10只。实验组每只大鼠左肺下叶一次性灌注0.1ml致癌物碘油混悬液(含10 mg MCA和10μl DEN),对照组每只大鼠灌注0.1ml碘油。于灌注后第15、35、55、65、75天随机抽取各实验组动物16只和对照组动物2只处死。取灌注部位病变组织,一分为二,一份抽提组织RNA和蛋白质,另一半置于4%多聚甲醛固定液中,常规石蜡包埋,制备成4μm和10μm厚的切片。利用激光捕获显微切割的方法获取正常和处于不同癌变阶段的组织细胞并提取DNA。2.采用抗5-甲基胞嘧啶(5-methycytosine, 5-mC)抗体免疫组化的方法,检测大鼠肺鳞癌癌变各阶段基因组甲基化水平,利用图像分析系统测量其平均光密度值和积分光密度值,从细胞形态学水平获取DNA低甲基化的发生情况;利用甲基化敏感性随机引物PCR(Methylation-sensitive arbitrarily primed PCR, MS-AP-PCR)方法分析了11例癌前病变组织和11例肿瘤组织及其配对的正常支气管上皮组织基因组DNA中异常甲基化的改变情况,观察癌变过程中DNA甲基化的差异;分离差异甲基化片段,克隆并进行测序;利用BLAST软件对序列的同源性进行分析,确定是否为已知基因。3.采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)和测序的方法检测癌变过程中肿瘤相关基因p15、p16、p27、p57、RASSF1A、TSLC1、TIMP-3、E-cadherin、N-cadherin、DAPK1、FHIT、SOCS-3高甲基化的发生情况;采用免疫组化检测p16、p27、p57、RASSF1A、TSLC1、TIMP-3、N-cadherin、DAPK1、FHIT、SOCS-3蛋白在大鼠肺鳞癌癌变各阶段的表达水平,采用Western blot检测各蛋白在正常、癌变和鳞癌组织中的表达水平。4.采用免疫组化检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)1、3a和3b在大鼠肺鳞癌癌变各阶段的表达水平,分析其与各肿瘤相关基因甲基化之间的关联;原代培养p16、p57、TSLC1基因甲基化大鼠肺鳞癌细胞,采用不同浓度(2μM、5μM、10μM)去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza-dC)处理,MSP和逆转录PCR(Reverse transcription-PCR, RT-PCR)分别检测处理前后各基因甲基化和mRNA表达的情况。5.所有参数均采用SPSS13.0统计软件分析处理,各基因甲基化发生频率和各蛋白阳性率差异比较以及甲基化和表达的相关性分析采用χ2检验,方差分析用于分析组间均数差别,双侧概率检验,检验水平α为0.05及0.01两种。结果:1.灌注后15-75天分批处死大鼠,大体病理观察发现对照组左肺无明显改变,实验组大鼠左肺下叶有直径0.5cm-1cm不等的肿块。HE切片染色,光镜下观察发现,对照组无明显的增生性或肿瘤性病变;实验组出现从正常支气管上皮组织到肺鳞癌各阶段病变,包括支气管粘膜上皮过度增生、鳞状上皮细胞化生、不典型增生、原位癌以及广泛浸润癌,且多为一例病变组织中同时存在多个癌变阶段。癌变过程各阶段的计数结果:正常支气管上皮20例(包括对照组和实验组各10例)、上皮增生25例、鳞状化生27例、不典型增生37例、原位癌30例、浸润癌25例。2.抗5-mC抗体在支气管上皮细胞胞核表达,正常对照组胞核呈棕黄至黄褐色,随着癌变过程的延续,染色程度逐渐变淡,至浸润癌阶段胞核呈浅黄色。癌变各阶段细胞胞核染色基底层较腔细胞层深。支气管粘膜上皮增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌、浸润癌5-mC免疫组化平均光密度值和积分光密度值呈总体下降趋势,与正常对照组比值均有显著差异(P < 0.01);正常与癌变各阶段支气管上皮基底层细胞平均光密度值和积分光密度值比腔细胞层细胞层高,差异有显著性意义(P < 0.01)。3.利用MS-AP-PCR方法分析了11例癌前病变组织和11例肿瘤组织,及其配对的正常支气管上皮组织DNA中异常甲基化的改变情况,结果发现多数标本中均能发现异常甲基化片段。在200bp-700bp范围内,我们一共回收了8个扩增片段,其中低甲基化片段7个,高甲基化片段1个。通过克隆、测序和BLAST分析显示,8个DNA片段中有7个与大鼠基因组序列有高度同源(99%-100%的同源性)。这些序列位于大鼠的染色体1、3、9、12、13、20和X上,与细胞周期调控、细胞生长分化相关。采用MSP和测序的方法对高甲基化片段Hyper-1进行了鉴定分析,结果发现Hyper-1在正常组织中未发现甲基化,而在肿瘤和癌变组织中均发现甲基化。4. p15和E-cadherin在正常和癌变各阶段均未发生甲基化。其余肿瘤相关基因在癌变过程中甲基化程度逐渐增强,至少一个基因发生甲基化的频率和平均甲基化基因个数不断增加。正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段组织中甲基化频率分别为:p16:0%、8.00%、22.22%、40.54%、50.00%和56.00%;p27:0%、0%、0%、0%、3.33%和8.00%;p57:0%、0%、11.11%、18.92%、26.67%和36.00%;RASSF1A:0%、0%、3.70%、8.11%、6.67%和16.00%;TSLC1:0%、0%、18.52%、24.32%、40.00%和48.00%;TIMP-3:10.00%、12.00%、18.52%、24.32%、30.00%和60.00%;N-cadherin:0%、0%、7.41%、18.92%、26.67%和36.00%;DAPK1:0%、0%、7.41%、10.81%、26.67%和36.00%;FHIT:0%、0%、3.70%、16.22%、43.33%和48.00%;SOCS-3:0%、0%、7.41%、16.22%、26.67%和48.00%。相反,除N-cadherin表达增强外,其余各肿瘤相关基因蛋白在正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段组织中表达不断下降,阳性表达率分别为:p16:90.00%、84.00%、70.37%、59.46%、40.00%和32.00%;p27:95.00%、88.00%、74.07%、67.57%、60.00%和44.00%;p57:95.00%、92.00%、81.48%、75.68%、63.33%和56.00%;RASSF1A:100.00%、92.00%、70.37%、64.86%、53.33%和48.00%;TSLC1:95.00%、88.00%、55.56%、48.65%、43.33%和40.00%;TIMP-3:100.00%、96.00%、77.78%、70.27%、53.33%和24.00%;N-cadherin:0%、0%、14.81%、21.62%、33.33%和44.00%;DAPK1:100.00%、100.00%、88.89%、81.08%、70.00%和56.00%;FHIT:100.00%、96.00%、81.48%、62.16%、43.33%和36.00%;SOCS-3:100.00%、100.00%、88.89%、86.49%、73.33%和56.00%。Western blot结果:未甲基化且免疫组化阳性的标本蛋白表达较强,甲基化且免疫组化阴性的标本蛋白表达较弱或无表达。p16、p57、TSLC1、TIMP-3、DAPK1、FHIT、SOCS-3基因甲基化与蛋白表达呈显著负相关。5.正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段DNA甲基转移酶的阳性表达率分别为:DNMT1:0%、16.00%、29.63%、40.54%、46.67%和64.00%; DNMT3a:0%、0%、18.52%、37.84%、40.00%和68.00%;DNMT3b:0%、0%、0%、5.41%、10.00%和12.00%。DNMT1与DNMT3a、DNMT3b表达均呈显著正相关(P < 0.05),DNMT3a与DNMT3b表达无相关(P > 0.05)。DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达与肿瘤相关基因甲基化相关性分析结果显示:p16、p57、TSLC1基因甲基化分别与DNMT1和DNMT3a的表达呈显著正相关(P < 0.01),此外,RASSF1A、TIMP-3、N-cadherin基因甲基化与DNMT3a的表达呈显著正相关(P < 0.01)。DNMT1和DNMT3a表达阳性的标本中平均甲基化基因数目是2.43±1.85和2.65±1.82,显著高于表达阴性的标本中平均甲基化基因数目1.35±1.98和1.34±1.95。对p16、p57、TSLC1基因甲基化的大鼠肺鳞癌原代细胞进行去甲基化试剂处理后,其基因mRNA表达水平显著升高。结论:1.采用支气管灌注MCA和DEN两种致癌物成功建立Wistar大鼠肺鳞癌癌变模型。2.基因组甲基化水平的降低在肺癌癌变早期就已发生,高甲基化和低甲基化共同存在于癌变组织和肿瘤组织中,并且在MCA和DEN诱导的大鼠癌变过程中起到非常重要的作用。筛选出的差异性甲基化片段所在区域可能是化学致癌癌变过程中改变的敏感地区,这些序列可以探索作为接触致癌物质的潜在生物标志物。经鉴定的高甲基化片段,提示其可能来自新基因,并且高甲基化可能与相关基因转录抑制有关。3.细胞周期调控相关基因p16、p27、p57、RASSF1A,细胞黏附相关基因TSLC1、TIMP-3、N-cadherin,凋亡相关基因DAPK1、FHIT以及SOCS-3基因高甲基化导致的基因沉默是MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌癌变过程中的早期和频繁的事件,并在此过程中起重要作用。4. DNMT1和DNMT3a表达的增加是癌变过程中一个具有特征的早期分子改变,共同调控基因甲基化的发生,参与了MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌发生发展的全过程。5. DNA甲基化是肿瘤相关基因失活的重要机制,并且CpG岛高甲基化导致的基因沉默是一个可以逆转的过程。综上所述,MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌模型可以从表遗传学机制来阐明致癌物在诱发癌变过程中的作用及其机制,丰富传统的“遗传学致癌理论”。建立的实验体系,为进一步全面评价环境因素与DNA甲基化相互作用参与肺癌癌变的发生奠定了基础,也将对传统的基于“突变检测”的致癌物的评价体系起到完善作用。同时,本研究为进一步研究相关基因如何通过表遗传学/遗传学的相互作用介导相关信号通路参与癌变提供资料,也为利用该模型筛选新的脱甲基化制剂用于肺癌治疗以及评价我国环境因素与DNA甲基化相互作用在肺癌发生中的机制提供方法学和实验模型。