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目的构建microRNA-21 (miR-21)反转录病毒过表达载体,通过转染肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞系MHCC-97H,获得稳定上调miR-21的细胞株。探讨miR-21与肝癌干细胞(liver cancer stem cell, LCSCs)之间的关系及其可能的作用机制,以及对细胞克隆、侵袭、转移以及裸鼠成瘤能力的影响。方法1.设计miR-21前体引物,PCR扩增目的基因,通过提取目的基因和质粒DNA、双酶切、T-A连接、转化感受态细胞等构建pB ABE-puro-pre-miR-21反转录病毒载体和空白对照质粒。将其与包装质粒混合共转染293T细胞,产生反转录病毒液。2.取对数生长期MHCC-97H细胞接种于六孔板中,分为两组：感染pBABE-puro-pre-miR-21反转录病毒过表达载体作为实验组(pre-miR-21组)；感染慢病毒空载体作为对照组(NC组)。使用含有嘌呤霉素的培养基连续培养实验组和对照组细胞两个月,收集两组细胞。相对定量PCR法检测两组细胞miR-21表达量。3.利用相对定量PCR检测干细胞标志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4mRNA表达量变化,Western Blot检测干细胞标志物CD13. Ep-CAM、CD90和OCT4蛋白水平的表达。4.通过平板克隆实验和Transwell法分别检测miR-21过表达后MHCC-97H的成瘤和侵袭能力的变化。5.取pre-miR-21组和NC组细胞接种裸鼠皮下。观察成瘤情况、瘤体生长情况,绘制肿瘤生长曲线；34天后测定肿瘤最终体积和重量。结果1.成功包装出逆转录病毒载体质粒pBABE-puro-pre-miR-21和空载质粒pBABE-puro-NC的病毒液。2.转染后pBABE-puro-pre-miR-21组细胞miR-21表达量相对于空载组细胞上升了(7.78±1.51)倍,差异有统计学意义(p<0.05)。获得了miR-21过表达的稳定的细胞株。3.与NC组相比较,干细胞标志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4的mRNA在pre-miR-21组表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05)；干细胞标志物CD13、Ep-CAM、CD90和OCT4蛋白在pre-miR-21组表达明显升高,同时差异有统计学意义(P<0.05)。4.肝癌细胞系MHCC-97H过表达miR-21后的平板克隆的CFE为(24.8±3.1)%,明显高于NC组细胞(15.3±3.6)%,差异有统计学意义(P=0.026<0.05)。培养24小时后迁移实验中迁移至Transwell膜背面的细胞数为：NC组,(104.8±6.5)/HP; pre-miR-21组,(210.3 ±5.8)/HP。pre-miR-21组迁移细胞数显著高于NC组,差异有统计学意义(P<0.001)；细胞侵袭到膜背面的细胞数分别为：NC组,(56.7±2.5)/HP; pre-miR-21组,(107.3±2.3)/HP,显著高于NC组(P<0.001)。5. pre-miR-21组和NC组均在接种第5天出现肉眼可见的瘤体。第20天开始,NC组相对于pre-miR-21组瘤体生长的相对缓慢一些,两组相比较差异有统计学意义。第34天处死裸鼠后,发现pre-miR-21组瘤体体积大小为(773.62±163.46)(mm3)明显大于NC组(502.79±33.94)(mm3),差异有统计学意义(P=0.048<0.05)。裸鼠饲养第34天处死后,剥离出瘤体,称取瘤体重量pre-miR-21组(0.422±0.019)(g)重于NC组(0.346±0.006)(g),差异有统计学意义(P=0.003<0.05)。结论过表达miR-21后肝癌细胞侵袭和成瘤能力明显增强。miR-21增强肝癌的侵袭和成瘤能力可能与miR-21增强肝癌细胞干性有关。