研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,根据世界范围内的流行病学调查资料表明,结直肠癌在各类恶性肿瘤中的发病率居第3位。在西方发达国家,其发病率位居肿瘤第2位,在我国位居恶性肿瘤第4位。对于结直肠癌的治疗目前仍以外科手术为主,辅以放、化疗。结直肠癌的基因治疗作为一种新的治疗手段,近年来备受关注,很多相关研究已经进入临床试验阶段。结直肠癌基因治疗的主要策略包括：原癌基因沉默治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、自杀基因疗法、抑制肿瘤血管生成基因治疗、抗表皮生长因子受体治疗、肿瘤多药耐药基因治疗和多基因联合疗法等。抑癌基因(tumor suppress gene)也称为抗癌基因,在被激活的情况下它们具有抑制细胞增殖的作用,但在一定情况下被抑制或丢失后可减弱甚至消除抑癌作用。对抑癌基因的研究不仅有助于更好地明确结直肠癌发生机制,同时对结直肠癌的诊治有着重要价值。目前已分离克隆出20余种抑癌基因,在结直肠癌中常见抑癌基因有p53、p16、APC, MCC, DCC等。AT模体结合因子1(AT motif binding factor1,ATBF1)是一个新发现的抑癌基因,Morinaga T等从人肝癌细胞HuH-7中完整分离出了一个全长cDNA编码的蛋白与人甲胎蛋白基因增强子AT富集元件相结合。ATBF1蛋白包括4个同源结构域和17个锌指结构,多个在调控转录的片段。人ATBF1基因定位于染色体16q22.3-q23.1,通过选择性剪接产生ATBF1-A和ATBF1-B两种mRNA:ATBF1-A编码404kDa蛋白,3703个核苷酸；ATBF1-B编码306kDa蛋白,与ATBF1-A相比N末端缺少920个核苷酸。ATBF1-A是ATBF1基因的主要表达形式,其能抑制癌细胞生长,而ATBF1-B则能促进癌细胞增殖。研究证实在乳腺癌细胞中ATBF1基因的启动子甲基化程度、基因碱基突变在乳腺癌细胞里并不是影响ATBF1表达的主导模式,而ATBF1的基因表达下调才是影响其功能的主要因素；而且,ATBF1基因的第3381密码子缺失能提高人体对前列腺癌变发生的易感性[6];Yong Gu Cho等报道81例散发胃癌患者中8例存在4种突变：1例错义突变和3种缺失突变,ATBF1杂合缺失比例占52.9%,在胃癌细胞中ATBF1还能进入细胞核内与癌基因MUC5AC相互作用,抑制后者的转录调节功能；Jung, C. G等研究发现在神经细胞中ATBF1的超表达会导致细胞周期的停滞,从而会直接影响到神经元的分化。这些研究结果表明：ATBF1在不同的组织中,所起的抑癌作用有着明显的差别。根据目前的研究结果可知ATBF1在小肠绒毛的基底部和隐窝中均有表达,同时ATBF1移码突变伴随着高度微卫星不稳定现象的发生会影响结直肠癌的发生,结直肠癌的肝转移发生率较高,且有出现产AFP结直肠癌的相关病例报道,但是ATBF1基因对结直肠癌的发生相关研究极少。因此本文研究了ATBF1蛋白在结直肠癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况及其与临床病理特征之间的关系,探讨了ATBF1-A蛋白在不同分化结直肠癌组织中的表达情况,分析了ATBF1蛋白及ATBF1-A蛋白在不同的细胞株中的表达情况及转移相关性,探索了ATBF1蛋白的表达与ATBFlmRNA的表达情况之间的关系,揭示了ATBF1在结直肠癌中作为抑癌基因的角色,为进一步的干预研究提供理论和临床依据。研究方法1.结直肠癌组织中ATBF1的表达及临床意义1. lATBF1蛋白在结直肠癌中的表达及其与临床病理之间的相关性本研究收集了南方医科大学珠江医院及南方医科大学南方医院2012年2月～2013年2月间未经放疗、化疗及生物治疗的结直肠癌患者癌组织146例和癌旁粘膜组织146例,并统计其详细病理资料。运用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测了146例结直肠癌患者癌组织及癌旁组织中ATBF1蛋白的表达情况,分析ATBF1蛋白的表达情况与临床病理特征之间的关系。1.2ABFT1-A蛋白的表达与结直肠癌分化程度的相关性分别选取已经被确诊为高、中、低分化的结直肠癌癌组织和癌旁组织,通过免疫印迹方法检测不同分化程度的结直肠癌组织和癌旁组织中的ATBF1-A蛋白的表达情况。分析不同分化程度的结直肠癌癌组织与癌旁组织中ATBF1-A蛋白表达差异性。1.3ATBF1mRNA在结直肠癌组织的表达情况及其与ATBF1蛋白表达相关性本研究选取了38例术前未经放疗、化疗及生物治疗被确诊为结直肠癌的中分化患者癌组织及癌旁组织。通过RT-PCR检测癌组织及癌旁组织中mRNA的表达情况。并分析ATBFlmRNA表达与ATBF1蛋白表达的相关性。2. ATBF1蛋白在结直肠癌细胞株中的表达情况2.1ATBF1蛋白在LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株中的表达本研究选取了LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株5株常见的结直肠癌细胞株。通过激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscopy)检测ATBF1蛋白的表达情况,并分析其在胞浆和胞核的表达情况。2.2ATBF1-A蛋白在结直肠癌细胞株中的表达通过免疫印迹检测LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株5株细胞株中ATBF1-A蛋白的表达情况。2.3ATBF1mRNA在结直肠癌细胞株中的表达情况及其与ATBF1蛋白表达相关性通过RT-PCR检测了LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株中ATBF1mRNA的表达情况。分析ATBF1mRNA表达与ATBF1蛋白表达的相关性。3、数据的统计学处理将纳入研究的146例结直肠癌患者分为转移组和非转移组,通过SPSS14.0运用卡方检验和秩和检验(P<0.05)检测转移组和非转移组患者纳入标准相同。ICH每张切片随机选取3～5个不同的观察视野,计算目的蛋白阳性细胞表达率,并进行两个样本的配对t检验(P<0.05)以确定ATBF1蛋白在结直肠癌癌组织和癌旁组织中表达的差异性；同时通过卡方检验明确ATBF1蛋白与临床病理特征之间的相关性(P<0.05)；对激光共聚焦结果和免疫印迹结果采用光密度对比分析；结直肠癌组织的RT-PCR结果采用配对t检验(P<0.05)以确定癌组织及癌旁组织间的表达差异性,结直肠癌细胞株的RT-PCR结果通过2-△△CT计算出细胞株中ATBF1mRNA相对表达量并进行对比分析。研究结果1.1ATBF1蛋白在结直肠癌中的表达及其与临床病理特征之间的相关性在结直肠癌组织中ATBF1的阳性率仅为56.2%(n=82),而癌旁组织中ATBF1的阳性率为82.9%(n=121)；经统计学分析两组差别有显著统计学意义(p<0.05).即ATBF1蛋白在癌旁组织中的表达量明显高于在癌组织中的表达量。结果显示ATBF1蛋白与肿瘤分化程度、淋巴转移情况有关(P<0.05),与性别、肿瘤位置、T、N分期、Dukes分期无明显相关(P>0.05)；癌旁组织和癌组织中的ATBF1的表达量存在着差异,而且这种差异随着分化程度由高到低会越来越明显。1.2ABFT1-A蛋白的表达与结直肠癌分化程度的相关性ATBF1-A蛋白的表达与结直肠癌分化程度密切相关,分化程度越高ATBF1-A的表达量相对越高。癌旁组织中ATBF1-A蛋白表达量要高于癌组织中的表达量,且这种差别随着且分化程度的降低越明显。1.3ATBF1mRNA在结直肠癌组织的表达情况及其与ATBF1蛋白表达相关性实验结果表明,癌组织中ATBF1mRNA的表达量与癌旁组织中ATBF1mRNA的表达量的差别并不明显(P=0.1).结直肠癌癌组织中ATBF1mRNA的表达量与ATBF1蛋白表达的表达量之间的相关性无显著统计学意义。2. ATBF1蛋白在结直肠癌细胞株中的表达2.1ATBF1蛋白在LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞系的表达通过激光共聚焦显微镜观察发现ATBF1蛋白在LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞系中均有表达,但是各个细胞株中的表达量均不相同。研究发现不同的细胞系中ATBF1蛋白在胞质和胞核中的表达量各不相同。实验结果表明转移性较强的LOVO细胞株较转移性较弱的SW480而言,ATBF1表达量明显降低。不同的细胞株中胞浆和胞核中ABF1的表达存在明显差异,SW480细胞株核内ATBF1表达明显高于其他细胞株。2.2ABFT1-A蛋白在结直肠癌细胞株中的表达通过免疫印迹(westen blot)检测可知,ATBF1-A蛋白在sw480细胞株中的表达量最高,在LOVO细胞株中表达量最低,其他细胞株中表达量从高到低依次为：SW620细胞株、LS174T细胞株、HCT116细胞株。而这一检测结果与激光共聚焦的检测结果基本一致。2.3ATBF1mRNA在结直肠癌细胞株中的表达情况及其与ATBF1蛋白表达相关性运用2-△△CT计算出每个细胞株中ATBF1RNA水平的相对与LOVO细胞株的表达量。结果发现转移性较强的LOVO细胞株较转移性较弱的SW480细胞株中ATBF1mRNA表达含量要低。最高的是LS174T细胞株,而这一统计结果与ATBF1蛋白.表达统计结果趋势不具有一致性。但是可以肯定的是转移性较强的LOVO细胞株较转移性较弱的SW480细胞株中RNA表达量明显要低。结论1、ATBF1在结直肠癌中表现为抑癌基因,在癌旁组织中的表达量明显高于癌组织中的表达量；2、ATBF1蛋白的表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关；3、ATBF1-A蛋白的表达量与结直肠癌分化程度相关,分化程度越低表达量越低。4、ATBF1蛋白的表达与ATBF1mRNA的表达之间的相关性不明显；5、不同的细胞株中ATBF1蛋白的表达量不相同；6、不同的细胞株中ATBF1在细胞核和胞浆中的分布不同；7、不同的细胞株中ATBF1-A蛋白的表达量不同；8、ATBF1mRNA的表达与肿瘤细胞转移性相关,与ATBF1蛋白表达相关性不明显。本研究的创新之处本研究首次探索了ATBF1在结直肠癌病理标本中的表达情况,同时研究了ATBF1在LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株中的表达情况；讨论了ATBF1-A蛋白在不同分化组织中的表达情况及在LOVO细胞株、HCT116细胞株、LS174T细胞株、SW620细胞株、SW480细胞株中的表达情况；分析了ATBF1在结直肠癌组织中的表达情况与临床病理之间的相关性和ATBF1蛋白在结直肠癌细胞株细胞质和细胞核分布的差异性；探讨了ATBF1的表达与结直肠癌转移相关性及分化相关性。