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卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是卵生动物中卵黄蛋白的前体。卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)是Vtg被卵母细胞吸收后水解的主要产物之一。本文以西伯利亚鲟(Acipenser baerii)卵为实验材料,采用Sephacryl S-300和DEAE Fast-Flow两步层析方法纯化出其Lv。Native-PAGE表明其分子量为320 KDa,SDS-PAGE显示其由三个分子量分别为30.6 KDa、40.8 KDa和76.7 KDa的亚基构成。将西伯利亚鲟Lv进行电泳后分别进行糖、磷、脂特异性染色,结果表明均为阳性,进一步证实了西伯利亚鲟Lv是一种富含糖脂磷蛋白的大分子蛋白。用纯化所得到的西伯利亚鲟Lv与佐剂混匀后免疫小鼠来制备多克隆抗体。通过Western Blotting方法来检测所得抗体的特异性,结果表明西伯利亚鲟Lv的抗血清具有较好的特异性。
以E2来诱导西伯利亚鲟幼鱼三周,取血清两步层析法分离出其Vtg,于Native-PAGE分析表明其分子量高达390KDa。并且西伯利亚鲟Lv抗血清能与纯化的西伯利亚鲟Vtg发生免疫印迹反应,这说明Lv与Vtg具有相同的免疫原性。
在自然状态下只有产卵期间的雌鱼肝脏VTG基因才大量表达,而雄鱼和幼鱼中是不表达的。本研究通过对受诱导的西伯利亚鲟幼鱼肝中VTG基因表达情况的分析发现其肝脏中VTG基因被提前激活。表明外源性E2可诱导未成熟幼鱼体内VTG基因的激活表达。
对中华鲟(Acipenser sinensis)的Lv进行了分离纯化,Native-PAGE确定其分子量为340 KDa,对比西伯利亚鲟中Lv分子量稍大,经SDS-PAGE分析得出其是由单一分子量为43.5 KDa的亚基所构成。中华鲟Lv蛋白中可能由相同分子量大小的亚基聚合而成,相比西伯利亚鲟Lv蛋白结构较简单。对西伯利亚鲟和中华鲟Lv的氨基酸组成进行比较,证明两种鲟鱼Lv中都是一种含有相对较多天冬氨酸、谷氨酸和缬氨酸的蛋白,且各自Lv中均有半胱氨酸检出,说明两种鲟鱼Lv蛋白均由多亚基构成。另外西伯利亚鲟Lv抗血清不能与中华鲟的Lv起反应,显示两种鲟鱼Lv也具有高度的种特异性。