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1.目的以类风湿关节炎(RA)“从脾论治”的观点为指导原则,以FAK/Calpain信号通路为研究靶点,观察新风胶囊对RA血小板活化及肺功能损伤的影响,阐明FAK/Calpain信号通路在RA血小板活化及肺功能损伤的分子机制,探讨新风胶囊调控FAK/Calpain信号通路抑制血小板活化改善RA肺功能损伤的分子机制。2.方法2.1动物实验研究将75只大鼠随机按每组15只分为正常组(NC),模型组(MC),假手术组(SHAM),雷公藤多苷片组(TPT)和新风胶囊组(XFC)。除NC组外,其余大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂(FCA)0.1 ml致炎造模,第15 d在尾根部注射FCA 0.05 ml加强免疫,第19 d给药。各组的给药量如下:XFC组0.034g/1ml/100g,TPT组0.57mg/1ml/100g,NC、MC组予生理盐水9mg/1ml/100g,SHAM组不做任何处理;1次/天,连续用药90 d。观察各组大鼠体足跖肿胀度(E)、关节炎指数(AI)、血小板参数、肺功能变化,光镜观察滑膜、肺组织形态学变化,流式细胞术检测GPIIb/IIIa、CD40L、CD147表达,ELISA法检测细胞因子表达,RT-q PCR、免疫组化、Western blot法分别检测肺组织FAK/Calpain通路指标及纤维化指标(ColⅠα、ColⅢ、α-SMA)的变化。2.2体外实验研究通过体外实验分别对血小板、肺成纤维细胞进行培养和血小板-肺成纤维细胞共培养,先用ADP进行诱导血小板活化建立模型,TGF-β1诱导肺成纤维细胞建立模型,然后分别用新风胶囊含药血清、雷公藤内酯醇、FAK抑制剂、Calpain抑制剂进行血小板和肺成纤维细胞体外干预,最后将各组血小板与TGF-β1诱导肺成纤维细胞进行共培养。肺成纤维细胞增殖率采用CCK-8法检测,CD62p、GPⅡbⅢa水平采用流式细胞术检测,细胞因子IL-6水平采用ELISA检测,ColⅠα、ColⅢm RNA表达采用RT-q PCR检测,FAK、p-FAK、Calpain1、Calpain2、α-SMA蛋白表达采用Western Blot检测,免疫荧光检测肺成纤维细胞中p-FAK、α-SMA表达。3.1动物实验研究结果3.1.1XFC疗效学研究3.1.1.1AA大鼠关节炎症指标的变化与NC组比较,MC组、SHAM组大鼠E、AI升高(P<0.01)。与MC组比较,XFC组和TPT组E、AI降低(P<0.01)。与TPT组比较,XFC治疗组无统计学意义(P>0.05)。3.1.1.2AA大鼠关节及肺组织病理形态学变化与NC组比较,MC组与SHAM组大鼠足趾关节滑膜增生,分层增多并增厚,有突起呈绒毛状凸向关节腔内,有少量新生血管形成,并且有大量炎性细胞的浸润。肺组织有大量炎性细胞的浸润,炎性细胞以中性粒细胞为主,可见少量的肺泡上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞,甚至可见成纤维细胞的增殖,大量胶原纤维的沉积。通过药物干预后,XFC组、TPT组大鼠足趾关节滑膜中炎性细胞明显减少,可见部分滑膜组织突起,嵌入关节腔内,滑膜分层也减少。肺组织中的炎性细胞明显减少,偶见成纤维细胞增值,胶原纤维蛋白也明显减少,肺泡结构较规整,肺泡腔得到改善,肺间隔也缩窄。与TPT组相比,XFC大鼠滑膜衬细胞分层较少;而关节面较清晰,滑膜突起也有所改善。肺组织中炎性细胞稍减少,肺泡间隔缩窄,其他改善则不太明显。3.1.2XFC对相关指标的影响3.1.2.1 AA大鼠肺功能参数及纤维化指标的变化与NC组比较,MC组、SHAM组大鼠肺功能参数FVC、FEF25、FEF50、FEF75、PEF明显降低(P<0.01),ColⅠαm RNA、ColⅢm RNA、α-SMA表达升高(P<0.01)。与MC组比较,XFC组和TPT组FEF50、FEF75、PEF均显著升高(P<0.05或P<0.01),ColⅠαm RNA、ColⅢm RNA、α-SMA表达降低(P<0.01)。与TPT组比较,XFC组肺功能参数FEF50、FEF75明显升高(P<0.05),ColⅠαm RNA、ColⅢm RNA、α-SMA表达降低(P<0.05或P<0.01)。3.1.2.2AA大鼠肺组织FAK/Calpain通路指标的变化与NC组相比,MC组、SHAM组FAKm RNA和FAK、p-FAK蛋白表达升高,Calpain1、Calpain2m RNA和Calpain1、Calpain2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);与MC组相比,TPT组、XFC组FAKm RNA和FAK、p-FAK蛋白表达降低,Calpain1、Calpain2m RNA和Calpain1、Calpain2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与TPT组相比,XFC组FAKm RNA和FAK、p-FAK蛋白表达降低,Calpain2m RNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。3.1.2.3 AA大鼠血小板参数及活化标志物的变化与NC组比较,MC组、SHAM组血小板参数PLT、PCT、CD40L、CD147、GPIIb/IIIa明显升高(P<0.01)。与MC组比较,XFC组和TPT组PLT、CD40L、CD147、GPIIb/IIIa均明显下降(P<0.05)。与TPT组相比,XFC组CD40L、GPIIb/IIIa表达降低(P<0.01)。3.1.2.4 AA大鼠外周血血小板中FAK/Calpain通路的变化与NC组相比,MC组、SHAM组FAK、p-FAK表达升高,Calpain1、Calpain2降低(P<0.01)。与MC组相比,TPT组、XFC组FAK、p-FAK表达降低,Calpain1、Calpain2升高(P<0.05)。与TPT组相比,XFC组FAK、p-FAK表达降低,Calpain1、Calpain2升高(P<0.01)。3.1.2.5 AA大鼠血清细胞因子的变化与NC组比较,MC组和SHAM组细胞因子IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF显著升高,IL-27显著降低(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,XFC组细胞因子IL-8、TGF-β1、VEGF表达量降低,IL-27表达升高(P<0.05或P<0.01);TPT组IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF降低,IL-27升高(P<0.05或P<0.01)。与TPT组比较,XFC治疗组IL-8、TGF-β1表达量降低(P<0.05)。3.1.3各指标之间的相关性研究3.1.3.1肺功能参数及胶原纤维蛋白与FAK/Calpain通路、关节炎症、细胞因子、血小板相关指标相关性相关性分析显示:FVC与FAK、PLT呈负相关(P<0.01);FEF25与p-FAK、IL-6、TGF-β1、PLT呈负相关(P<0.05);FEF50与Calpain2呈正相关,与AI、E、IL-8、PDW呈正相关(P<0.05或P<0.01);FEF75与Calpain2呈正相关,与E、TGF-β1、PLT、CD40L、CD147、GPⅡbⅢa呈负相关(P<0.05或P<0.01);PEF与Calpain2呈正相关,与E、IL-8呈负相关(P<0.05或P<0.01);ColⅠα与FAK、TGF-β1、VEGF、PLT、CD40L、GPⅡbⅢa呈正相关(P<0.05或P<0.01);ColⅢ与Calpain2呈负相关,与AI、IL-8、VEGF呈正相关(P<0.05或P<0.01);α-SMA与FAK呈正相关(P<0.05)。3.1.3.2外周血血小板与FAK/Calpain通路、关节炎症指标及细胞因子的相关性相关性分析显示:PLT与E、IL-6、IL-8、FAK、p-FAK、Calpain1呈正相关(P<0.05),PCT与与Calpain2呈负相关(P<0.05),PDW与AI呈正相关(P<0.05),CD40L与E、IL-6、IL-8、FAK、p-FAK呈正相关(P<0.05),CD147与IL-6、TGF-β1、FAK、p-FAK、Calpain1呈正相关(P<0.05),GPIIb/IIIa与E、IL-6、IL-8、p-FAK呈正相关(P<0.05)。3.2体外实验结果3.2.1不同浓度的XFC对体外血小板活化的影响与空白对照组相比,经过20μmol/L的ADP诱导后的血小板活化标志物GPⅡb/Ⅲa、CD62p水平明显升高(P<0.05)。随后分别将高中低剂量的XFC加入经过20μmol/L的ADP诱导处理后的活化血小板中进行干预,与模型组相比,新风胶囊高中低剂量组的GPⅡb/Ⅲa水平明显降低(P<0.05),新风胶囊高、中剂量组的CD62p水平明显降低(P<0.05),低剂量组的CD62p水平无统计学变化(P>0.05);并且XFC对血小板活化呈现剂量依赖式。3.2.2 XFC对体外干预后血小板活化产物的影响与空白组相比,模型组(20umol/L的ADP诱导处理后的活化血小板组)血小板活化标志物GPⅡb/Ⅲa、CD62p表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,XFC干预组的GPⅡb/Ⅲa、CD62p表达水平明显降低(P<0.05);与XFC干预组相比,20μM FAK inhibiter干预组GPⅡb/Ⅲa、CD62p表达水平明显降低(P<0.05),50μM Calpeptin干预组GPⅡb/Ⅲa、CD62p表达水平明显升高(P<0.05)。3.2.3不同药物对肺成纤维细胞的增殖率影响将50ng/m LTGF-β1刺激建立的肺成纤维细胞模型中分别加入L-XFC、M-XFC、H-XFC、(5、10、15、20)nmol/L TPL作用于细胞,放入培养箱培养24h、48h、72h后检测肺成纤维细胞增殖率,发现XFC和TPL对肺成纤维细胞增殖的抑制呈现明显的剂量依赖式,其中H-XFC作用24h对肺成纤维细胞增殖抑制达到最大,而5nmol/L TPL作用24h就已经对肺成纤维细胞增殖抑制达到最大,故H-XFC和5nmol/L TPL为最佳刺激浓度。3.2.4XFC对体外干预的肺成纤维细胞分泌的炎症因子IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA水平的影响与空白对照组相比,TGF-β1诱导后肺成纤维细胞分泌的IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,H-XFC干预和5nmol/LTPL干预组的细胞培养液中的IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA分泌水平均明显降低(P<0.01)。与单纯H-XFC干预和5nmol/LTPL干预组相比,20μM FAK inhibiter干预组细胞上清液中的IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA水平明显降低(P<0.01或P<0.05),而50μM Calpain inhibiter干预组细胞上清液中的IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA水平明显升高(P<0.01),50μM Calpain inhibiter干预组与20μM FAK inhibiter干预组相比,细胞上清液中的IL-6、ColⅠα、ColⅢ、α-SMA水平明显升高(P<0.01)。3.2.5 XFC对体外培养肺成纤维细胞中FAK/Calpain信号通路水平影响与空白对照组相比,TGF-β1诱导后肺成纤维细胞中FAK、p-FAK蛋白水平明显升高,Calpain1、Calpain2蛋白水平明显降低(P<0.01;P<0.01);与模型组相比,H-XFC干预组的肺成纤维细胞中FAK、p-FAK蛋白水平明显降低,Calpain1、Calpain2蛋白水平明显升高(P<0.01;P<0.01);与单纯H-XFC干预组相比,20μM FAK inhibiter干预组细胞中FAK、p-FAK蛋白水平明显降低,Calpain1、Calpain2蛋白水平明显升高(P<0.01;P<0.01);而50μM Calpain inhibiter干预组FAK、p-FAK蛋白水平明显升高,Calpain1、Calpain2蛋白水平明显降低(P<0.01;P<0.01)。3.2.6XFC对血小板-肺成纤维细胞共培养后肺纤维化相关指标的影响与单纯50ng/ml TGF-β1诱导的肺成纤维细胞组相比,血小板与肺成纤维细胞共培养组的肺成纤维细胞增值率明显升高(P<0.01),细胞上清液中IL-6水平明显升高(P<0.01),肺成纤维细胞中ColⅠαm RNA、ColⅢm RNA水平明显升高(P<0.01);随后将H-XFC加入ADP诱导的血小板与TGF-β1诱导的肺成纤维细胞共培养,结果显示,XFC组的细胞增殖率、IL-6、ColⅠαm RNA、ColⅢm RNA均明显降低(P<0.01)。4结论4.1AA大鼠存在血小板参数及活化标志物水平的升高及肺功能参数的降低,且血小板活化能够进一步加重肺功能的损伤。其分子机制是:由于机体受到炎症的刺激,进而出现细胞因子网络的失衡,激活FAK信号通路,抑制Calpain信号通路活化,促进血小板活化及肺功能的损伤,且血小板活化后分泌的大量活化标志物能够进一步加重肺功能的损伤。4.2XFC能够改善AA大鼠的足趾肿胀度和关节炎指数,同时抑制血小板活化,改善肺功能损伤。并具有类似于FAK抑制剂及Calpain信号通路的作用。其分子机制是:XFC能够通过抑制免疫炎症反应,恢复细胞因子网络的平衡状态,抑制FAK信号通路的活化,促进Calpain信号通路的活化,抑制AA大鼠血小板活化,改善肺功能损伤。