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乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一类长期应用于食品发酵、生物医药工业且被公认为安全的食品级微生物(Generally Regard as Safe,GRAS),近年来,探究一些有实际应用价值的基因在乳酸菌中的克隆和表达,构建带有食品级选择标记的乳酸乳球菌表达系统已成为乳酸菌分子生物学的研究热点。目的:将原有大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭表达质粒pMG36e中的红霉素抗性基因敲除,引入Nisin抗性基因nisI作为选择标记,构建食品级表达载体pMG36N。方法:(1)根据GenBank报道的乳链菌肽Nisin抗性基因nisI的序列,设计引物P1和P2,以pLEB590为模板,扩增出编码脂蛋白NisI的nisI片段;(2)将nisI片段进行TA克隆、酶切鉴定及测序之后,亚克隆至大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭表达载体pMG36e中,重组子命名为pMG36e-NisI;(3)再将pMG36e-NisI电转化至对Nisin敏感的乳酸乳球菌MG1363中,以考察pMG36e-NisI在MG1363中的遗传稳定性;(4)设计特异性引物P3和P4,对重组质粒pMG36e-NisI进行红霉素抗性基因的敲除,以构建食品级表达载体pMG36N;(5)在以Nisin为选择压力的培养条件下,将增强型绿色荧光蛋白EGFP导入表达质粒pMG36e-NisI及pMG36N中,以考察EGFP在MG1363中的表达情况。结果:(1)构建了克隆载体pMD19-NisI。(2)构建了表达载体pMG36e-NisI,将pMG36e-NisI电转化至对Nisin敏感的乳酸乳球菌MG1363中,获得的重组菌MG1363/pMG36e-NisI在含有20IU Nisin/mL的培养基中生长情况良好,遗传性能稳定,这表明nisI基因赋予了宿主菌MG1363对Nisin的抗性,由此可知,nisI可以作为筛选标记用于食品级表达载体的构建。(3)构建了表达载体pMG36e-NisI-EGFP及pMG36N-EGFP,通过试验发现,在受强组成型启动子P32的启动下,EGFP能够在NisI的下游进行活性表达。