雪灵芝多糖的分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

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本文以雪灵芝为原料,分别采用水提醇沉以及碱提醇沉的方法,对雪灵芝活性多糖的提取工艺进行研究;并对水提雪灵芝粗多糖进行了分离和纯化及初级结构鉴定;通过体外模拟实验和动物实验研究了雪灵芝多糖对活性氧自由基的清除效果及对小鼠在密闭缺氧条件下耐缺氧能力的影响。主要研究结果如下:1雪灵芝多糖的两种提取方法及其提取工艺优化依次对雪灵芝多糖水提取工艺及碱提取工艺进行研究。雪灵芝多糖水提工艺研究采用三元二次正交试验考察了浸提温度、浸提时间、加水比对雪灵芝多糖提取率的影响。以雪灵芝多糖提取率为响应值,建立了试验因子与响应值回归方程:Y=8.169492+1.1985*X1+0.55475*X2+0.69725*X3-0.264944*X1*X1-0.12675*X2*X1-0.136194*X2*X2-0.095*X3*X1-0.0715*X3*X2-0.175819*X3*X3,并建立数学模型。经计算机模拟寻优确定了水提雪灵芝多糖提取工艺参数的最佳取值范围为:浸提温度(94.5℃-97.5℃);浸提时间(2h-2.5 h);加水比(43 v/w-51 v/w)。雪灵芝多糖碱提工艺研究在单因素试验的基础上,采用普通正交试验确定了雪灵芝多糖碱提工艺最佳提取工艺参数:浸提温度为95℃,浸提时间1.5h,液料比为30:1v/w,氢氧化钠浓度为2.5 mol/L;2水提雪灵芝多糖的分离及纯化采用DEAD-Sephadex A-25纤维素离子交换柱色谱及Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱色谱对除杂后的雪灵芝粗多糖进行纯化分级。结果表明:除杂后的水提雪灵芝多糖经过DEAD-Sephadex A-25纤维素离子交换柱色谱纯化分级后得到五个级分,分别为:AMP1、AMP2、AMP3、AMP4、AMP5,回收率分别为26.53%、5.77%、9.31%、18.32%、7.41%;分别取AMP1、AMP4经Sephadex G-75凝胶柱色谱分级后,得到精制雪灵芝多糖AMP1-B、AMP4-A,回收率别为32.32%和27.17%。3雪灵芝多糖AMP1-B、AMP4-A的初级结构鉴定采用紫外光谱、红外光谱、气相色谱等分析方法对雪灵芝多糖的结构进行初步研究。结果表明:AMP1-B和AMP4-A均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔比分别为:0.27:0.20:0.29:1.0:0.85:0.73;0.37:0.4:0.41:1.0:0.68:0.86。雪灵芝多糖AMP1-B与AMP4-A都具有多糖类物质的特征吸收峰,不具有三螺旋结构,并含有较长的侧链和较多的分支,且含有少量糖蛋白,存在O-糖苷键。4雪灵芝多糖体外抗氧化及耐缺氧试验通过体外抗氧化试验,研究了不同种类的雪灵芝多糖对羟基自由基和DPPH自由基的清除作用;并通过动物实验研究了不同种类雪灵芝多糖对小鼠在密闭缺氧条件下耐缺氧能力的影响,并对效果最明显的雪灵芝多糖RAMP的剂量效应关系进行了一定的研究。结果表明:碱提雪灵芝粗多糖(AAMP)以及水提雪灵芝粗多糖(WAMP)对羟基自由基和DPPH自由基的清除效果最佳;AMP的对小鼠耐缺氧能力的提高效果最明显,而中剂量AMP对小鼠耐缺氧能力的影响最大,并能较好的缓解缺氧损伤。
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