鸭肝炎病毒部分cDNA文库的构建及鸭IgG的特性

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用蛋白酶K消化粗提的鸭肝炎病毒(DHV),酚-氯仿抽提后再与生物素化Oligo(dT)杂交,通过共价结合有链霉亲和素的顺磁微珠捕获RNA-Oligo(dT)杂合体,采用磁性分离技术,得到了高纯度的DHV RNA。经测定,OD260/OD280=2.2,琼脂糖凝胶电泳只有一条均一的核酸带,大小约为7—8kb。用Oligo(dT)15为引物,用禽反转录酶(AMV)反转录DHV RNA,合成了cDNA用T4 DNA连接酶与接头连接,磷酸化后,与经EcoRⅠ酶切并去磷酸化的载体pUC19连接成重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,构建了DHV部分cDNA文库,通过颜色筛选及小量质粒酶切的方法,共筛选到80个阳性克隆,经酶切鉴定,插入片段大小为1—7kb。将部分阳性菌落的质粒测序,并与小RNA病毒科的其它成员作序列比较,结果显示,鸭肝炎病毒与泰勒鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)接近。文库的构建和序列的测定丰富了DHV的分子生物学内容,对它的研究意义深远。 为深入了解为何不能用鸭抗体来进行凝集或沉淀实验检测DHV,又进行了鸭免疫球蛋白的研究。 用四周龄肉鸭静脉内两次注射绵羊红细胞(SRBC)或鸡红细胞(CRBC)进行免疫,下蛋母鸭用更高剂量的CRBC进行静脉内注射免疫。免疫后收集肉鸭血清,母鸭血清及母鸭后代的血清,用直接血凝实验测定它们对相应抗原的滴度,结果发现鸭免疫CRBC产生的滴度稍高于SRBC,但是二者的滴度都相当的低。母鸭首免后的后代血凝滴度极低,二免后滴度有所提高。用牛血清白蛋白(BSA)皮下或静脉注射免疫鸭,虽然采用了各种措施,但免疫后鸭血清的血凝效价都非常低;琼脂扩散实验没有出现沉淀线。 用辛酸-硫酸铵法提取鸭IgG,同时把该法与传统的提取方法进行了比较,结果表明,该法提取的IgG纯度高,比色谱层析快速,简单,而且廉价。本文也把几种提取鸡卵黄抗体的方法试用于提取鸭卵黄抗体。 通过比较,找到适合鸭IgG的提取方法,为进一步研究其性质奠定基础 通过对鸭卵黄抗体在不同温度下处理和在不同酸碱度下处理后发现,鸭IgG在温度不高于70℃和pH4—12之间稳定,它可以耐受45%蔗糖渗透压。这些特点表明鸭卵黄抗体比鸡的稳定性强。紫外光谱和荧光光谱进一步揭示了其活性丧失的原因。将提纯的7.8S,5.7S IgG作薄板等电聚焦,结果显示鸭IgG等电点为5.6,6.2,6.9,鸭IgG等电点与鸡IgY的等电点(5.2、5.3、6.6)有差异。 推测可能是由于鸭IgG肽链间的作用力比较强,提高了它的稳定性,但同时也减少了鸭IgG铰链区的柔韧性,使其在功能上成为单价,因而不能发生凝集和沉淀反应。
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