结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病。结核病的疫情仍然非常严重,已成为目前全球最严重的公共卫生问题之一。据WHO估计,全球约有1/3的人感染结核分枝杆菌,2012年有860万新发病例,死亡人数为130万。结核分枝杆菌感染宿主后会引起宿主的免疫应答反应并产生多种细胞因子。其中IFN-γ是抵抗结核分枝杆菌感染最主要的细胞因子。IFN-γ是一种Ⅱ型干扰素主要由活化T细胞、NK细胞产生,能激活巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除具有重要意义。因此本实验主要是研究对IFN-γ具有调控作用的结核分枝杆菌蛋白。1.候选蛋白的选择本实验以结核分枝杆菌H37Rv株为研究对象筛选出一些可能对IFN-γ具有调控作用的结核分枝杆菌脂蛋白,膜蛋白和分泌蛋白。通过生物信息学方法和结核分枝杆菌蛋白质组学的综合考虑本实验共选取了173个蛋白基因作为候选基因。针对这些蛋白的目的基因序列设计出使引物所带有的酶切位点尽量相同PCR的引物。2.候选蛋白真核表达质粒的构建本实验以结核分枝杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后将克隆得到的目的基因连接至pcDNA3.1-V5/HisB载体中,构建了相关蛋白的真核表达质粒173个由于本实验需要构建大量的真核表达质粒,因此采用了一些使实验简便的方法。首先将酶切位点相同的目的基因同时进行PCR,然后将PCR产物与目的载体同时酶切回收。接下来测定回收产物的浓度,将各种目的基因的浓度调节一致混合之后同时与载体连接。将连接产物转化,挑取一定数量的单菌落摇菌、小提质粒、酶切鉴定和送测序。最后通过序列比对挑选出构建成功的质粒。3.调控IFN-γ启动子活性的结核分枝杆菌蛋白的筛选由于本实验采用双荧光素酶检测系统进行筛选,因此需要构建IFN-γ启动子荧光素酶报告质粒。对IFN-γ启动子进行预测之后,设计出扩增IFN-γ启动子的引物。本实验以提取的Hela细胞的基因组为模板成功扩增得到了大小为602bp人源IFN-γ启动子的目的基因并将目的基因连接到pGL3-Basic载体上从而成功构建了IFN-γ启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告质粒。将所成功构建的173个结核分枝杆菌蛋白的真核表达质粒分别与IFN-γ启动子荧光素酶报告质粒共转染Hela细胞进行双荧光素酶的检测。通过筛选得到部分对IFN-γ启动子具有调控作用的蛋白,其中蛋白Rv0720对IFN-γ启动子具有一定的抑制作用并呈现一定的剂量依赖性；蛋白Rv3623对IFN-γ启动子具有一定的刺激作用并呈现一定的剂量依赖性。4.对候选蛋白在蛋白水平的研究为了研究结核分枝杆菌蛋白在蛋白质水平对IFN-γ的调控本实验首先选择了对IFN-γ启动子具有明显调控作用的蛋白Rv0720、Rv3623。蛋白Rv3763与蛋白Rv0720、Rv3623都属于膜磷脂蛋白,同时已有文献报道对蛋白Rv3763进行研究发现该蛋白具有诱导细胞凋亡的作用。因此虽然本实验在双荧光素酶的检测中发现蛋白Rv3763对IFN-γ启动子的调控作用较弱,但仍然想在蛋白质水平研究该蛋白对IFN-γ的调控作用,于是本实验将蛋白Rv0720、Rv3763和Rv3623的基因克隆至PGX-KG载体中,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导表达之后提取包涵体,再对得到的蛋白进行去内毒素处理。最后用得到的蛋白处理RAW264.7细胞,并通过荧光定量和ELISA检测IFN-γ含量的变化。结果这三种蛋白均未表现出对IFN-γ具有调控作用。