前言：　　抗有丝分裂药物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)，通过阻断DNA和RNA的合成，诱导细胞凋亡，并减缓或停止细胞增殖。由于其作用并非只针对肿瘤组织，还会诱发对快速增殖细胞，如骨髓和肠黏膜细胞的有害影响。在细胞毒性药物治疗后临床表现出消化道毒性如粘膜炎，粘膜溃疡融合可影响整个消化道，导致如吞咽困难，呕吐，腹泻，体重减轻，直肠出血和感染症状。目前没有有效的规范治疗方法，减少口腔和胃肠道的肠黏膜炎。化疗导致肠毒性的分子机制仍不明确。因此研究进步预防干预作用仍然是一个挑战。　　肠黏膜的机械屏障由连续的肠黏膜上皮细胞、其间的连接和黏膜的特殊结构以及肠表面黏液层组成。肠黏膜机械屏障的结构基础是完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接，两者共同构成肠道的选择性屏障，并调控着水和溶质的跨上皮细胞转运。细胞间的连接有紧密连接、黏附连接、缝隙连接和桥粒等，而紧密连接则是肠上皮细胞间主要的连接方式。　　肠上皮还创建了免疫屏障调节管腔共生细菌与黏膜免疫系统的相互作用。肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)，尤其是小肠的潘氏细胞，产生和释放抗菌因子减少细菌在肠上皮表面的定植的数量，调节肠道复杂的细菌的组成。为了其重要免疫调节功能，IEC需要检测肠道细菌和调整他们的反应，旨在维持自身动态平衡。IEC表达几种模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），包括Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和NOD样受体(Nod-like receptors, NLRs)，检测到共生的细菌。触发这些受体诱导激活核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)等促炎途径产生抗菌因子，细胞因子，趋化因子和其他分子促进上皮细胞和肠黏膜免疫细胞之间联系。　　谷氨酰胺(glutamine，GLN)是血液中最丰富的氨基酸，它是主要的肠上皮细胞代谢前体。肠细胞很大程度上依赖于谷氨酰胺作为代谢前体，合成如核苷酸，氨基糖和蛋白质。它是目前应用非常广泛的肠黏膜保护剂，是维持肠道黏膜代谢、结构和功能的必须营养成分，对维护肠黏膜细胞的生长、分化和增殖具有重要的意义。本文通过研究MTX模型鼠小肠炎症发生机制，了解谷氨酰胺是否与肠上皮细胞间紧密连接和NF-κ Bp65通路调节有关，进一步揭示MTX诱发的肠粘膜病理状态分子机制，以及谷氨酰胺是否对其有保护作用。　　实验材料和方法　　一、动物模型及分组　　10-12周SD大鼠，体重250-300g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。随机分为3组。每组16只。根据腹腔注射药物的不同将SD大鼠分为3组:CON组(control group):腹腔注射生理盐水1ml连续2天，每日口服灌胃生理盐水1ml。　　MTX组:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)连续2天，每日口服灌胃生理盐水1ml。　　GLN组:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)连续2天，每日口服灌胃GLN1ml(2g/kg·d)。　　二、实验标本采集及处理　　造模后每天观察动物一般状况、粪便情况及称量体重;各组于注射MTX后第6，8天各随机取8只鼠，10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，留取肠标本后处死。　　1、无菌操作下取回盲部末段回肠4cm，用冰盐水灌注，清除小肠内容物，分别放入4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片;2.5％戊二醛中保存，行电镜检测。病理组织学观察为盲法。取0.1g肠组织加1ml PBS充分剪碎后离心，留上清用于ELISA检测。　　2、留取肠组织2cm，以无菌生理盐水冲洗肠腔，滤纸吸干水分，消毒锡纸、纱布包裹，标记，放入液氮中速冻并转-70℃深冻冰箱保存，用于Real time quantitiveRT-PCR及Western Blotting检测。　　三、试验方法及检测指标　　1、动态观察大鼠一般状态、体重和排便情况。　　2、病理形态学研究　　(1)各组动物于各时间点处死后，剖开腹腔，观察肠管颜色、有无水肿、出血、扩张、透壁溃疡及粘连。　　(2)光镜观察:小肠组织常规固定后，H-E染色，光镜下观察小肠组织形态学改变。　　(3)电镜观察:小肠组织固定后，常规作透射电镜观察小肠组织超微结构和肠绒毛的变化。　　3、ELISA检测肠组织白细胞介素IL-6，IL-23，IL-17含量。　　4、免疫组化法测定ZO-1，Occludin，Claudin-1分布及表达。　　5、实时定量PCR分析ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κBp65表达。　　6、Western Blot法测定肠组织ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κBp65蛋白表达。　　四、统计学分析　　计量资料结果以均值±标准差((X)±S)表示，差异比较用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采用方差分析LSD法(Least significant difference)。P＜0.05提示有统计学意义。　　实验结果：　　一、一般情况　　MTX组大鼠在注射MTX后3天出现体毛凌乱，精神差，食欲下降，粘液便等症状，至第6天症状达到高峰，伴体重下降明显平均下降8.2％，至第八天时体重逐渐恢复增加平均减少6.9％。GLN组大鼠出现上述症状时症状略轻，6天时体重平均减少6.2％。对照组大鼠活泼，进食好，体重增加明显。　　二、光镜下病理变化观察　　对照组大鼠小肠组织，粘膜腺体排列整齐，隐窝表面上皮完整，粘膜固有层有少许淋巴细胞，无明显炎性细胞浸润。光镜下观察MTX给药后第6天可见广泛粘膜下层中性粒细胞及其它炎性细胞浸润水肿明显。损伤部位四周粘膜腺体排列不齐或破坏，杯状细胞减少甚至消失，肠壁水肿;损伤评分与对照组相比有差异（P＜0.05）。GLN组与MTX组粘膜比较损伤减轻(P＜0.05)，炎细胞浸润减弱，水肿减轻。MTX造模后8天，与造模后6天相比粘膜损伤多为局部改变，非透壁性的，炎细胞浸润程度减轻，水肿存在，杯状细胞减少或消失，与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。GLN组与MTX组相比有显著性差异（P＜0.05）。　　三、肠组织在电镜下变化　　对照组肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列整齐，柱状上皮细胞结构完整;细胞质内细胞器丰富，结构未见异常;细胞间连接紧密。MTX组微绒毛变细、稀疏、排列不整、呈倒伏状，部分断裂、脱落;高尔基复合体水肿扩张，内质网肿张，细胞连接增宽。6天时电镜改变最明显。GLN组6天回肠电镜改变:肠上皮微绒毛局部缺损，排列不够规则，细胞器未见明显扩张。8天细胞损伤有所恢复，细胞连接略增宽，异染色质边集。　　四、ELISA检测肠组织白细胞介素IL-6，IL-23，IL-17　　6天时MTX组经ELISA分析见IL-6，IL-23，IL-17表达明显增强，MTX组表达明显强于GLN组，差异均显著（P＜0.05），较对照组表达明显增加。8天时MTX组表达明显强于GLN组，差异显著(P＜0.05)。　　五、肠组织ZO-1，Occludin和Claudin-1蛋白表达　　（一）免疫组化显示　　6天标本ZO-1，Claudin-1，Occludin于MTX组、GLN组蛋白表达减少，较对照组有差异(P＜0.05)，ZO-1，Occludin在GLN组蛋白表达较MTX组增多，差异显著(P＜0.05)。8天标本ZO-1，Occludin，Claudin-1于MTX组蛋白表达减少较对照组有差异（P＜0.05），GLN组蛋白表达与MTX组差异显著(P＜0.05)。　　（二）Western Blot检测肠组织ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-Bp65蛋白表达　　ZO-1，Occludin蛋白在第6天时对照组表达明显增强，MTX组表达明显弱于GLN组，差异均显著(P＜0.05)。8天时ZO-1，Occludin，Claudin-1 MTX组和GLN组与对照组比较差异显著(P＜0.05)，MTX组表达明显弱于GLN组，差异显著(P＜0.05)。　　NF-κBp65蛋白在第6天，8天时经WestenBiot分析见MTX组表达明显增多，GLN组表达明显弱于MTX组，差异均显著(P＜0.05)。MTX组和GLN组较对照组表达均增加(P＜0.05)。　　六、肠组织ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κB p65分子生物学显示　　GLN组、MTX组与对照组比较ZO-1，Occludin和Claudin-1的基因表达水平均有减低，两组变化趋势一致;基因水平在第6天减低明显，到第8天有所恢复，较对照组有显著差异（P＜0.05）。在第8天GLN组的基因表达均较MTX组升高，差异显著(P＜0.05)。　　GLN组、MTX组与对照组比较NF-Bp65的基因表达水平均有明显升高，两组变化趋势一致;基因水平在第6天升高明显，到第8天有所恢复，较对照组有显著差异（P＜0.05）。在第6天、8天MTX组的基因表达均较GLN组升高，差异显著(P＜0.05)。　　结论：　　1、GLN能减轻MTX诱导的大鼠肠粘膜炎症病理损伤，并能促进损伤的修复。　　2、针对由MTX诱导的大鼠肠炎模型口服GLN是一个方便而且有效的治疗方法。　　3、甲氨蝶呤诱导肠粘膜炎时，可以使紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1表达下调。　　4、应用谷氨酰胺对甲氨蝶呤诱导肠粘膜炎有保护作用机制之一可能与Occludin，Claudin-1，ZO-1表达有关。　　5、甲氨蝶呤诱导肠粘膜炎时使NF-κBp65表达上调。　　6、应用谷氨酰胺对甲氨蝶呤诱导肠粘膜炎保护作用机制之一可能与恢复NF-Bp65表达有关。