【摘 要】
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乳酸菌是应用广泛的益生菌种,对宿主的健康具有重要作用。肠出血性大肠杆菌是肠道致病菌,感染后多用抗生素进行治疗,而抗生素破坏肠道菌群的结构和组成,造成菌群失衡。肠道菌群在宿主的免疫等方面发挥重要作用。研究乳酸菌对大肠杆菌的抑制,有助于大肠杆菌的防治,减少抗生素的使用,对开发益生菌资源具有重要指导意义。本研究以鸡肠道组织为样品,体外以Caco-2细胞为模型筛选出抑菌能力强,耐受效果优并且具有粘附效果的
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乳酸菌是应用广泛的益生菌种,对宿主的健康具有重要作用。肠出血性大肠杆菌是肠道致病菌,感染后多用抗生素进行治疗,而抗生素破坏肠道菌群的结构和组成,造成菌群失衡。肠道菌群在宿主的免疫等方面发挥重要作用。研究乳酸菌对大肠杆菌的抑制,有助于大肠杆菌的防治,减少抗生素的使用,对开发益生菌资源具有重要指导意义。本研究以鸡肠道组织为样品,体外以Caco-2细胞为模型筛选出抑菌能力强,耐受效果优并且具有粘附效果的乳酸菌,体内以小鼠为模型,探究乳酸菌对大肠杆菌感染的小鼠肠道菌群的调节作用。1具有抑制大肠杆菌活性的乳酸菌分离与鉴定以健康鸡肠道为样品,利用革兰氏染色分离乳酸菌株;通过双层琼脂法,评价菌株对大肠杆菌的抑菌能力;通过生理生化鉴定和16S rDNA测序分析,对分离菌株进行种属鉴定;对分离菌株的生长和产酸能力进行测定;通过最小抑菌浓度方法测定菌株对常见抗生素的耐药情况;通过模拟胃液、胆盐溶液和模拟肠液,对居住的耐受能力进行评价。结果如下:共分离出31株疑似乳酸菌,其中10株有对指示菌的生长有很强的抑制能力,抑菌圈直径均大于10mm;鉴定得到1株约氏乳杆菌,1株副植物乳杆菌和8株植物乳杆菌,在4h后进入对数生长期并开始产酸,最终pH在3.4左右;10株菌对头孢西丁、卡那霉素、庆大霉素、万古霉素、红霉素、四环素耐药,对阿莫西林和青霉素敏感;10株菌的耐受能力较强,在胃液中1h的存活率最高有84.73%,3h后,L.johnsonii NJ13仍有73.63%的存活率,存活数目达106 CFU/mL以上,菌株在0.3%的胆盐溶液和模拟肠液中都能够存活,并且活菌数目与初始无显著差异,维持在108 CFU/mL。2抑制大肠杆菌能力的乳酸菌筛选10株乳酸菌通过自聚集、共聚集和表面疏水性三个指标的测定,初步评估乳酸菌的粘附能力;以Caco-2细胞为体外模型,评价乳酸菌粘附情况,并筛选得到一株粘附指数高的大肠杆菌以做指示菌来评估乳酸菌对大肠杆菌抑制的能力;对L.johnsonii NJ13的粘附性质探究;主成分分析指标,筛选出效果最佳的乳酸菌;通过Caco-细胞模型,测定筛选得到的乳酸菌对大肠杆菌粘附和IL-8过表达的抑制。结果发现乳酸菌的自聚集能力在29.43%-89.64%之间,与粘附能力呈正相关,疏水能力在11.04%到65.60%之间,与粘附呈负相关,10株菌菌具有良好的益生菌特性;L.plantarum NJ55、L.plantarum NJ56、L.plantarum NJ57、L.plantarum NJ59粘附能力强,粘附指数高于鼠李糖乳杆菌标准菌株;通过不同pH处理L.johnsoniiNJ13,发现其在偏酸性环境下的粘附个数要对于碱性条件（pH=9）,金属Ca2+可以提高粘附能力,Na+,Mg2+,K+,NH+对粘附没有影响,不同化学物质处理菌体后L.johnsonii NJ13的粘附可能与表层蛋白、脂磷壁酸和胞外多糖有关;通过主成分分析得到两株最具潜力益生菌L.johnsonii NJ13和L.plantarum NJ56,两株菌可抑制大肠杆菌对Caco-2细胞的粘附率,并且对造成的IL-8的过表达具有明显的抑制作用。3乳酸菌对小鼠肠道菌群组成影响通过构建小鼠腹泻动物模型,采用108CFU/mL和109CFU/mL的L.johnsonii NJ13和L.plantarum NJ56和LGG进行灌胃,同时采用抗生素处理,对小鼠的体重、腹泻情况进行记录,灌胃结束后收集小鼠粪便,高通量测序分析小鼠肠道内菌群的组成与分布。结果:灌胃大肠杆菌7天后,小鼠体重下降,出现腹泻,抗生素和乳酸菌处理后,小鼠的体重回升,腹泻得到缓解。抗生素处理后Simpson指数达到最高值0.0242,说明小鼠肠道菌群的丰度和多样性最低,而L.johnsonii NJ13处理后Simpson指数最小,说明其对小鼠肠道菌群的结构和组成具有调节作用;乳酸菌增加了 了感染小鼠体内拟杆菌门和厚壁菌门比例,降低了变形菌门在肠道菌群内的分布。增加了肠道内乳酸菌等有益菌群的含量,减少了幽门螺旋菌等有害菌群的含量,促进了感染后小鼠的肠道菌群的恢复。差异分析显示,抗生素组的肠道菌群组成与正常组差异最为显著,而L.johnsonii NJ13组肠道菌群组成与正常组最为接近。
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