目的:贲门癌是我国特别是北方地区一种常见的消化道恶性肿瘤,国际卫生组织(World Health Organization,简称WHO)将骑跨于食管和胃交界处的腺癌性病变定义为贲门癌,其具有特异的临床表现与组织学、解剖学、生物学特征。因其病理类型多为腺癌,放疗治疗效果不理想。食管癌也是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年`新增患者超过30万人,其发病率和死亡率各国差异很大,其中发展中国家比例较高。食管癌的病理类型主要分为鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤、肉瘤样癌以及小细胞癌。我国是世界食管癌高发地之一,其死亡率占全球的50%以上,粗死亡率为17.38/10万,占总癌亡人数的16.41%。鳞状细胞癌为我国食管癌主要病理学类型,约占发病率的90%左右。目前,贲门癌和食管癌患者的主要治疗手段是手术治疗,但患者术后的生存期并不乐观,其5年生存率都仅为30%左右。贲门癌和食管癌有一些值得注意的病理学和流行病学相似点,如发病年龄、性别等。在食管癌高发区,贲门癌的发病率也较高,食管癌高发区贲门癌发病率约为50/10万,是食管癌的2/3,特别是河北省磁县和涉县等地区这一流行病学特征更为突出。因二者有相似的病理学、流行病学等特点,故进一步比较研究同一地区贲门癌与食管癌发病的分子学机制,对于寻找新的治疗靶点以提高个体化治疗效果,具有重要的理论意义和应用价值。BRAF基因,别名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体(v-rafmurinesarc-omaviraloncogenehomolog B1),位于染色体7q34由783个氨基酸组成,能够编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是RAF家族成员之一,而且还是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路中相当重要的转导因子,调控多种生物学事件,如细胞生长、分化和凋亡等。近年研究发现,在多种人类恶性肿瘤如恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌中均存在不同比例的BRAF基因突变。当前,在我国关于BRAF基因在贲门癌及食管鳞状细胞癌组织是否发生突变的研究鲜有报道。本研究采用基因测序的方法检测了在人贲门癌、食管鳞状细胞癌组织及其相对远癌组织(距癌组织边缘5cm以上)中BRAF基因第11外显子及第15外显子的突变情况,并运用免疫组化方法检测了贲门癌、食管鳞状细胞癌组织及相对远癌组织中BRAF蛋白的表达情况,分析了其与贲门癌及食管鳞状细胞癌临床病例特征各指标间的关系,探讨了BRAF基因突变在贲门癌及食管鳞状细胞癌的临床意义,为今后制备BRAF基因抑制剂、寻找应用于贲门癌及食管鳞状细胞癌分子靶向治疗的新靶点提供理论基础及实验依据。方法:收集河北医科大学第四医院胸外科在2014年2月-2014年12月期间经手术治疗的贲门癌、食管鳞状细胞癌患者新鲜组织标本共91例。其中贲门癌标本46例,食管鳞状细胞癌标本45例。在贲门癌标本中,男性患者38例,女性患者8例,男女比例为4/1,病人平均年龄为59.8岁,高分化4例,中分化22例,低分化20例。在食管鳞状细胞癌标本中,男性患者27例,女性患者18例,男女比例为3/2,病人平均年龄为61.3岁,高分化3例,中分化31例,低分化11例。所有患者术前均未进行放疗及化疗,全部手术切除标本均经病理证实。对照组选取这91例患者的新鲜远癌组织标本(距癌组织边缘5cm以上)。分别记录患者性别、年龄、病理类型、分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移等临床病例情况。采用组织全基因组提取、聚合酶链式反应(PCR)技术和基因测序方法,检测实验组和对照组标本中BRAF基因的突变情况,并运用免疫组化方法检测了两种癌组织及相应远癌组织中BRAF蛋白的表达情况,分析其与贲门癌及食管鳞状细胞癌临床病例特征的关系。采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,两组计数资料的比较采用四格表资料的卡方检验,两组等级资料的比较采用Mann-whitney U秩和检验,检测结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1贲门癌、食管鳞状细胞癌组织中BRAF基因突变检验结果及临床特点在46例贲门癌组织中检测到3例存在于BRAF基因第15外显子突变,其第11外显子均未见突变。突变类型均为V600E,即基因突变发生在第15外显子的第1799个核苷酸,导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代。在远癌组织中未检测到上述突变。免疫组化结果显示3例BRAF基因突变的贲门癌组织阳性表达BRAF蛋白;3例患者均伴有周围淋巴结的转移,均可见脉管瘤栓,TNM分期分别IIIB、IIIB、IIIC期,分化程度分别为II级、II级、III级,患者性别均为男性,年龄分别是59岁,68岁与55岁。在45例食管鳞状细胞癌组织中未检测到BRAF基因第11外显子和第15外显子存在突变。测序结果显示,有4个样品在第11外显子上增加了一个碱基C或T,即会造成密码子移码突变,结合免疫组化结果显示该标本BRAF蛋白阳性表达,考虑该结果可能为测序误差所致。2贲门癌、食管鳞状细胞癌组织中BRAF蛋白表达及临床病例特征之间的关系免疫组化结果显示在46例贲门癌组织标本中,22例贲门癌细胞中可见分布于肿瘤细胞胞浆中的棕色颗粒,BRAF蛋白表达呈阳性,表达阳性率为47.82%;在相应远癌组织中仅3例出现棕色颗粒,表达阳性率为6.52%。统计学分析显示,两者具有显著性差异(P<0.05)。在45例食管鳞状细胞癌组织标本中,28例食管鳞状细胞癌组织BRAF蛋白表达呈阳性,表达阳性率为62.22%;在相应远癌组织中仅4例出现棕色颗粒,表达阳性率为8.89%。统计学分析显示,两者具有显著性差异(P<0.05)。本研究显示46例贲门癌组织中BRAF蛋白阳性表达共22例,总的阳性率为47.82%。男性阳性率50.0%,女性阳性率37.5%;年龄60岁以上(包括60岁)患者阳性率60.0%,60岁以下患者阳性率38.5%;低分化者阳性率40.0%,中分化者阳性率59.1%,高分化者阳性率25.0%;Ⅰ期患者阳性率18.2%,Ⅱ期患者阳性率33.3%,Ⅲ期患者阳性率75.0%;有淋巴结转移者阳性率62.5%,无淋巴结转移者阳性率14.3%。统计学分析显示,BRAF蛋白的表达阳性与肿瘤淋巴结转移情况(χ2=9.073,P<0.05)及TNM分期(Z=-3.242,P<0.05)有关,与患者性别、年龄及肿瘤分化程度无关。45例食管鳞状细胞癌组织中BRAF蛋白阳性表达共28例,总阳性率为62.22%。分布为:男性阳性率55.6%,女性阳性率72.2%;年龄60岁以上(包括60岁)患者阳性率53.6%,60岁以下患者阳性率76.5%;低分化者阳性率72.7%,中分化者阳性率54.8%,高分化者阳性率100.0%;Ⅰ期患者阳性率21.4%,Ⅱ期患者阳性率50.0%,Ⅲ期患者阳性率88.2%;有淋巴结转移者阳性率82.6%,无淋巴结转移者阳性率40.9%。统计学分析显示,BRAF蛋白的表达阳性与肿瘤淋巴结转移情况(χ2=8.318,P<0.05)及TNM分期(Z=-3.718,P<0.05)有关,与患者性别、年龄及肿瘤分化程度无关。结论:1本实验结果提示BRAF基因突变在贲门癌的发展中具有一定作用,可能是贲门癌生存不良的新预测因素,可望作为贲门癌的分子靶向治疗新的目的基因。而BRAF基因突变可能不是食管鳞状细胞癌发生和发展的原因。2 BRAF蛋白高表达与贲门癌、食管鳞状细胞癌发生发展密切相关,BRAF蛋白表达在贲门癌和食管鳞状细胞癌的发展阶段发挥更多作用,其可能在贲门癌和食管鳞状细胞癌病理诊断和临床预后方面具有一定的应用价值。