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目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染已经成为全球公共健康问题，每年约有100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。活动性HBV复制是导致肝脏损伤和疾病进展的关键因素，因此最大限度地长期抑制或清除HBV成为慢性乙型肝炎治疗的总体目标。目前用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物主要有两大类:1、核苷（酸）类似物;2、干扰素(interferon，IFN)。干扰素具有抗病毒和免疫调节双重作用，治疗疗程短而确定、耐药少见，故逐渐成为临床治疗慢性乙型肝炎的主要选择。然而，目前干扰素治疗只能达到30％-40％的HBeAg血清学转换，约有60％的患者尽管接受干扰素抗病毒治疗，但仍然遭受乙肝病毒的侵害，因此短期内预测干扰素治疗疗效显得尤为重要，最新研究热点是干扰素抗病毒作用信号通路中的干扰素刺激基因，泛素特异性蛋白酶18(Ubiquitin-specificprotease18，USP18)是其中重要的一个干扰素刺激基因。本研究旨在探讨USP18在干扰素-α治疗慢乙肝过程中的预测意义及作用机制。
方法:选取慢性HBV感染者70例，均为免疫清除期患者，所有患者均进行肝组织活检，无明显干扰素抗病毒治疗禁忌症。留取受试者治疗前新鲜外周血提取PBMCs进行体外干扰素-α孵育刺激试验，并对受试者应用干扰素-α抗病毒治疗，进行随访观察24周，其中无病毒学应答患者(nonvirologicalresponse，NVR)18例，完全病毒学应答患者(completevirologicalresponse，CVR)32例，部分病毒学应答患者(partialvirologicalresponse，PVR)20例，健康对照10例。
1、体外干扰素-α孵育PBMCs:留取70例受试者治疗前新鲜外周静脉血，密度梯度离心法分离PBMCs，无血清培养基悬浮沉淀细胞，分为两组:第一组空白对照组（不加任何因子）;第二组加入干扰素-α因子刺激孵育PBMCs，4h后收集细胞。
2、对所有受试者应用干扰素-α抗病毒治疗随访观察，留取治疗0周、1周、12周、24周时新鲜外周血，密度梯度离心法分离收集PBMCs。
3、Trizol法抽提外周血单个核细胞总RNA，应用Real-timePCR法检测USP18、STAT1mRNA的表达水平。
4、RIPA法提取细胞总蛋白应用westernblot法检测USP18、STAT1、P-STAT1蛋白的表达水平。
结果:
1、健康对照组外周血PBMCs中USP18的表达为阴性
2、干扰素-α治疗过程外周血PBMCs中USP18mRNA水平变化
70例CHB患者在干扰素-α治疗过程中接受mRNA水平检测，将PBMCs中内参GAPDH相对表达量设定为1.00，与GAPDH表达量相比较，干扰素-α治疗前NVR组PBMCs中USP18的表达水平(0.073±0.026)较CVR组(0.043±0.023)及PVR组(0.044±0.022)高，差异有统计学意义（F=10.665，P＜0.01）;治疗1周时，各组PBMCs中USP18的表达水平明显升高，NVR组(0.098±0.023)、CVR组(0.071±0.027)、PVR组(0.074±0.027)，NVR组表达水平最高，差异有统计学意义（F=6.781，P=0.002）;治疗12周及24周时，各组表达水平为NVR组(0.097±0.024)(0.096±0.023)、CVR组(0.069±0.025)(0.066±0.025)、PVR组(0.075±0.026)(0.074±0.025)，NVR组表达水平仍最高，差异有统计学意义(F1=7.140，p=0.002;F2=8.654,P＜0.01)。
3、干扰素-α治疗过程外周血PBMCs中USP18蛋白水平变化
将PBMCs中内参β-actin相对表达量设定为1.00，与β-actin表达量相比较，干扰素-仅治疗前NVR组外周血PBMCs中USP18的表达水平(0.308±0.046)较CVR组(0.250±0.044)及PVR组(0.248±0.048)高，差异有统计学意义(F=11.151，P＜0.01);治疗1周后，各组USP18的表达水平明显升高，NVR组(0.563±0.050)、CVR组(0.431±0.047)、PVR组(0.428±0.047)，NVR组表达水平最高，差异有统计学意义(F=51.722，P＜0.01);治疗12周及24周时，各组表达水平为NVR组(0.568±0.051)(0.566±0.049)、CVR组(0.430±0.047)(0.429±0.045)、PVR组(0.426±0.047)(0.430±0.049)，NVR组表达水平仍最高，差异有统计学意义(F1=55.958，P＜0.01;F2=55.841,P＜0.01)。
4、体外干扰素-α孵育刺激PBMCs后形态学观察
PBMCs经2h贴壁后，可见部分细胞悬浮，多数细胞为B细胞和外周血DC，干扰素-α孵育刺激4h后未见形态学变化，细胞数目无明显变化。
5、体外干扰素-α刺激PBMCs后USP18、STAT-1Mrna/蛋白水平变化
体外干扰素-α刺激治疗前外周血PBMCs后，干扰素-α组PBMCs中USP18在mRNA/蛋白上的表达水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，而NVR组、CVR组及PVR组外周血PBMCs中STAT-1mRNA及其蛋白水平无显著性差异。
6、体外干扰素-仅刺激PBMCs后USP18表达水平与P-STAT-1表达水平的相关性
空白对照组及干扰素-α组PBMCs中P-STAT-1表达水平分别为:NVR组（0.25±0.02）、（0.58±0.05），CVR组（0.26±0.02）、（0.66±0.05），PVR组（0.26±0.01）、（0.65±0.05），干扰素-α组PBMCs中P-STAT-1表达水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，回归分析结果显示:干扰素-α刺激后PBMCs中USP18的表达水平与P-STAT-1的表达水平成负相关性，相关系数为:-0.753(P＜0.01)。
7、多种影响因素与干扰素-α治疗疗效的回归分析
将受试者的年龄、治疗前HBV-DNA基线水平、肝组织炎症分级、治疗前ALT水平、及治疗前PBMCs中USP18的表达水平多种因素与干扰素-α治疗疗效进行logisitic回归分析，通过逐步排除法，病毒载量、肝组织炎症分级及治疗前PBMCs中USP18的表达水平进入回归方程，y=0.588+20.552x1-39.299x2+19.641x3，回归方程有统计学意义(x2=35.682，P＜0.01)。
结论:
1、USP18的表达受干扰素刺激机体强烈诱导。
2、USP18通过干扰STAT1的磷酸化作用，抑制干扰素-α抗病毒信号通路。
3、HBV-DNA基线水平、肝脏炎症分级及治疗前PBMCs中USP18表达水平与干扰素-α治疗疗效均存在相关性，受试者治疗前PBMCs中高水平表达USP18影响干扰素-α治疗疗效。
4、USP18可能是干扰素-α治疗慢乙肝过程中一个重要的稳定的负性预测因子。