六味地黄汤(LW)是滋补肾阴的代表名方,在中医临床中被广泛应用。在近代临床医疗实践中,LW被广泛用于糖尿病、高血压、系统性红斑狼疮、更年期综合征等多系统、上百种疾病的治疗。LW的组方特征是三补和三泻,由熟地、山茱萸和山药构成“三补”,泽泻、牡丹皮和茯苓构成“三泻”,具有补泻结合,以补为主,寓泻于补的组方特点。多年来我们研究集体对六味地黄汤的药理学和化学进行了系统研究,并从调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)平衡的角度,对三补和三泻与LW的作用进行了比较性研究。结果表明,LW全方的免疫调节作用是三补和三泻相互协调与制约而产生的综合作用,而不是三补和三泻作用的简单相加,这提示LW的配伍具有高度的科学内涵。但目前尚缺乏从NIM网络角度对LW配伍规律进行系统的研究,值得我们进一步深入探讨。　　代谢组学是系统生物学中重要组成部分之一,通过整体和动态地研究比较机体生理与疾病状态的代谢物组,寻找某些疾病的一组标志代谢物,其全面性和系统性的特点与中医药整体观、系统观具有高度的一致性,适用于中医药的研究。因此,本研究从NIM网络角度入手,以系统生物学观念为指导,将传统药理学研究方法与现代科学技术结合,采用宏观与微观、分析与综合相结合的方法,宏观上研究肾阴虚证NIM网络失衡的特点和LW全方及三补组分、三泻组分对模型动物症状和NIM网络失衡的改善作用;微观上重点应用代谢组学技术,寻找“肾阴虚证特异性相关代谢物”和六味地黄汤全方及三补、三泻组分共同和特异性影响的代谢物,进而探讨六味地黄汤物质基础与配伍、药效之间的内在联系,为最终揭示六味地黄汤配伍组方的科学意义探索研究方法和提供实验依据。　　一、LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚模型小鼠的影响　　本实验选择目前相对公认的外源性糖皮质激素所致肾阴虚的模型动物,具体方法为造模前7天开始灌胃给予动物蒸馏水或LW全方(10g/kg)、三补(6.4g/kg)和三泻(3.6g/kg),给药7天后开始造模;各组动物分别皮下注射生理盐水、醋酸可的松混悬剂25mg/kg×2,连续7天,于造模第六天进行尿液采集。　　1.LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠血清cAMP和cGMP水平的影响　　应用放射免疫分析法观察LW及不同组分对模型动物血清cAMP和cGMP水平的影响,结果表明,与正常对照组相比,肾阴虚小鼠血清cAMP水平显著上升, cGMP水平显著下降,两者比值显著上升。LW全方可显著降低 cAMP/cGMP比值,单用三补或三泻均未观察到上述作用。结果提示,肾阴虚小鼠cAMP和cGMP平衡失调,三补三泻组成全方后才能对其产生改善作用,说明三补三泻经过配伍可能产生了新的治疗作用。　　2.LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠神经内分泌免疫调节网络的影响　　2.1 LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠下丘脑垂体肾上腺(HPA)轴的影响　　下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH),垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)和血清皮质酮(CORT)水平可反映HPA轴的功能,本研究应用放射免疫分析法和ELISA法观察LW及其各组分对模型动物下丘脑CRH、垂体ACTH以及血清CORT水平的变化。结果表明,与正常对照组相比,模型动物三种激素水平均降低,LW全方能显著升高肾阴虚小鼠HPA轴各环节激素水平;三补可显著升高肾阴虚小鼠垂体ACTH水平;三泻则对肾阴虚小鼠HPA轴各环节激素均无明显改善作用。结果提示,肾阴虚小鼠HPA轴发生紊乱,LW全方可通过对HPA轴各环节激素的调节改善HPA轴紊乱,而三补或三泻单独作用均不如LW全方。　　2.2 LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠下丘脑垂体性腺(HPG)轴的影响　　下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH),垂体黄体生成素(LH)和血清睾酮(T)水平可反映 HPG轴的功能,本研究应用放射免疫分析法、ELISA法和化学发光法观察LW及其各组分对模型动物下丘脑GnRH、垂体LH和血清T水平均的变化。结果表明,与正常对照组相比,模型动物三种激素水平均降低。LW全方可显著升高GnRH、LH和T水平;三补可显著升高GnRH水平;三泻则可显著升高GnRH和LH水平。提示肾阴虚小鼠HPG轴发生紊乱,LW全方对其HPG轴紊乱具有明显调节作用,而三补或三泻对HPG轴紊乱具有部分调节作用,二者配伍后作用更加全面。　　2.3 LW及不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠免疫功能的影响　　应用3H-TdR掺入法观察LW及其不同组分对模型动物脾细胞增殖能力的影响。结果表明,与正常对照组相比,肾阴虚小鼠ConA及LPS诱导的脾细胞增殖能力均明显降低,LW全方和三补对两者均有明显改善作用,三泻对前者有明显的改善作用。提示肾阴虚小鼠细胞免疫和体液免疫功能下降,LW全方能明显调节其免疫功能低下,三补三泻与全方作用相似,且具有协同和相互补充的作用。　　进而应用流式细胞仪观察LW及其不同组分对肾阴虚小鼠脾脏T细胞亚群的影响。结果表明,肾阴虚小鼠CD4+T细胞百分率显著上升,CD8+T细胞百分率显著下降,CD4+/CD8+T细胞比值显著升高。LW全方可显著升高CD8+T细胞百分率、降低CD4+/CD8+T细胞比值,而三补或三泻对它们均无明显改善作用。提示LW可改善T细胞亚群比例失衡,三补三泻配伍后才能产生较好的治疗作用。　　3.LW及其不同组分对醋酸可的松致肾阴虚小鼠尿液中代谢物的影响　　应用核磁共振技术观察 LW及其不同组分对肾阴虚小鼠尿液中代谢物的影响。结果表明,模型与正常对照小鼠尿液的代谢物谱可明显区分,与正常组相比,其尿液中醋酸等11种代谢物水平上升,亮氨酸等6种代谢物水平下降。LW及各组分可使其不同程度地接近正常对照组。给予LW后,肾阴虚小鼠尿液中醋酸等12种代谢物水平上升。其中LW全方特异性作用的代谢物包括马尿酸等5种代谢物,丙氨酸是三补特异性作用的代谢物,而三补与三泻比较,三补可作用于二甲胺和柠檬酸,而三泻则无此作用。提示肾阴虚小鼠出现了糖代谢、蛋白质和氨基酸代谢、能量代谢以及脂代谢的功能紊乱,肝脏功能可能出现了损伤。LW及各组分可在不同的代谢环节改善动物体内各物质代谢的紊乱,其中LW全方对模型动物各物质代谢的紊乱具有全面的改善作用,三补对糖代谢和能量代谢的改善作用不如全方全面,但在调节蛋白质和氨基酸的代谢紊乱上有其特异的作用环节。三泻虽然对糖代谢、能量代谢和蛋白质代谢紊乱有一定的改善作用,但作用环节明显不如全方和三补全面。　　二、LW及其不同组分对快速老化型小鼠的影响　　本研究应用6和12月龄SAM,每天灌胃给予蒸馏水或LW全方(10g/kg)、三补(6.4g/kg)和三泻(3.6g/kg),连续60天,实验第58进行尿液采集。　　1.LW及其不同组分对快速老化小鼠血清cAMP和cGMP水平的影响　　应用放射免疫分析法观察 LW及其不同组分对快速老化小鼠血清 cAMP和cGMP水平的影响。6和12月龄SAMP8血清cAMP和cGMP水平均有不同程度地下降,而两者比值均显著升高,LW可显著降低6月龄SAMP8 cAMP/cGMP比值,但对12月龄无明显影响,并且三补、三泻改善作用均不明显。另外,12月龄SAMP8 cAMP/cGMP比值显著高于6月龄SAMP8,提示SAMP8存在cAMP和cGMP平衡紊乱,可能具有肾阴虚证的特点,且SAMP8随月龄增加此病理变化有加重趋势。LW全方可明显调节其平衡紊乱,而拆方后此改善作用消失,一方面提示SAMP8出现了肾阴虚相关的病理生理变化,另一方面提示只有LW全方具有“滋补肾阴”的作用。　　2.LW及其不同组分对快速老化小鼠神经内分泌免疫调节网络的影响　　2.1 LW及其不同组分对快速老化小鼠HPA轴的影响　　应用放射免疫分析法观察 LW及其不同组分对快速老化小鼠下丘脑 CRH水平垂体ACTH的影响,应用ELISA法观察LW及其不同组分对快速老化小鼠血清CORT水平的影响。结果表明,6和12月龄SAMP8 CRH、ACTH和CORT水平均显著升高,而LW及三补可明显降低6月龄SAMP8三种激素水平以及12月龄SAMP8的CRH水平。而三泻仅可明显降低6月龄SAMP8 CRH水平,提示SAMP8 HPA轴功能亢进,LW可显著改善6月龄SAMP8 HPA轴功能的亢进,但对12月龄SAMP HPA轴功能亢进的改善作用不明显,而三补表现出与全方相似的药物疗效,三泻作用不明显,三补和三泻通过配伍可达到增强药效的效果。　　2.2 LW及其不同组分对快速老化小鼠HPG轴的影响　　分别应用放射免疫分析法,ELISA法和化学发光法观察LW及其不同组分对动物下丘脑GnRH,垂体LH水平和血清T水平的影响。结果表明,LW对6和12月龄SAMP8 GnRH和LH水平均升高以及T水平下降均有明显的改善作用,而三补对6月龄时GnRH、LH水平和12月龄时LH水平有明显改善作用。三泻则仅对6月龄时LH水平有明显改善作用。提示SAMP8存在 HPG轴的功能紊乱, LW全方对其有明显改善作用,三补表现出与全方相似的作用,而三泻与全方的作用差别较大,三补和三泻通过配伍组成全方后才可发挥更加全面的效应。　　2.3 LW及其不同组分对快速老化小鼠免疫功能的影响　　应用3H-TdR掺入法观察LW及其不同组分对快速老化小鼠脾细胞增殖能力的影响。结果发现,与同龄SAMR1相比,6和12月龄SAMP8 ConA和LPS诱导的脾细胞增殖反应均明显降低。LW全方对6月龄SAMP8两者均有明显的改善作用,三补可明显改善6和12月龄SAMP8 ConA诱导的脾细胞增殖反应的下降,三泻对12月龄SAMP8 ConA诱导的脾细胞增殖反应的下降有明显改善作用。　　进而应用流式细胞仪观察LW及各组分对6月龄快速老化小鼠脾脏T细胞亚群的影响,结果表明,LW全方及各组分对 SAMP8脾脏 CD4+T细胞百分率和CD4+/CD8+T细胞比值的降低具有明显改善作用。　　上述结果提示,LW及其不同组分对SAMP8免疫系统功能障碍具有不同程度改善作用,三补三泻配伍组成全方后的作用更加显著。LW及其不同组分对快速老化模型小鼠尿液中代谢物的影响,16和12月龄SAMP8与SAMR1的差异代谢物及SAMP8代谢物随增龄的动态变化　　应用核磁共振技术观察LW及其不同组分对快速老化模型小鼠尿液中代谢物的影响。结果表明,与同龄SAMR1相比,6和12月龄SAMP8尿液的代谢谱明显不同,能够相互区分。与同龄SAMR1相比,6月龄SAMP8尿液中酪氨酸等5种代谢物水平下降,牛磺酸等10种代谢物水平上升。与同龄SAMR1相比,12月龄SAMP8尿液中肌酸等10种代谢物水平下降,丙氨酸等7种代谢物水平上升。提示与SAMR1比较,6和12月龄SAMP8糖代谢、能量代谢和蛋白质和氨基酸代谢等均出。