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孔雀石绿(Malachite Green,MG)是一种有毒的三苯甲烷类化学物,进入水产动物体内后,会被代谢还原成为无色的隐性孔雀石绿(Leucomalchite Green,LMG)。MG及LMG对水生生物和人体具有致癌、致突变、致畸作用。我国已经严令禁止其应用于水产保鲜中,但违禁使用现象仍有发生,需要加强监测。免疫检测方法具有简单、快捷、灵敏的特点,是一种高通量的筛选手段。免疫检测方法的核心材料是抗体。基因工程抗体是继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代抗体,具有制备周期短、可大规模发酵制备等优点,是近年来的研究热点。本论文在前期获得的抗LMG的单链抗体scFv基础上,构建了scFv-Biotin,Fab,scFab三种重组抗体,并以其分别建立免疫检测法,进而对三种抗体的特异性和稳定性进行评价,具体研究内容和结果如下:(1)三种重组抗LMG抗体表达载体的构建抗LMG的生物素标记单链抗体表达载体pComb3xss-LMG-scFv-BirA的构建与鉴定。根据文献报道BirA酶基因序列设计引物,以大肠杆菌DH5α菌株为模板进行PCR反应,扩增得到大小约1000 bp的PCR产物并测序。将序列放入在线网站Blast进行比对,结果显示与已公布的BirA酶基因序列一致。将LMG-scFv基因和BirA酶基因分别连接到载体p Comb3xss,经酶切与测序鉴定,重组质粒pComb3xss-LMG-scFv-BirA构建成功。抗LMG的Fab抗体表达载体p Comb3xss-LMG-Fab的构建与鉴定。以pComb3xss-LMG-scFv-BirA重组质粒为模板,扩增获得357 bp的VH基因和324 bp的VL基因。以p3MH-Fab为模板扩增获得306 bp的CH1基因和318 bp的CL基因。用重叠延伸PCR方法分别将VH和CH1、VL和CL拼接,获得663 bp的Fd段和642 bp的κ基因。将Fd段和κ段分别酶切连接到载体p Comb3xss,酶切与测序结果显示,重组质粒pComb3xss-LMG-Fab构建成功。抗LMG的scFab抗体表达载体pComb3xss-LMG-scFab的构建与鉴定。以pComb3xss-LMG-Fab重组质粒为模板,扩增获得Fd和κ基因。用重叠延伸PCR方法将Fd和κ基因用连接肽(Gly4Ser)3连接,获得1362 bp的scFab基因。将scFab基因连接到载体pComb3xss,并经过酶切与测序鉴定,表明重组质粒pComb3xss-LMG-scFab构建成功。(2)三种重组抗体的诱导表达和鉴定将三种表达载体转化进入大肠杆菌Top10’中,构建三种工程菌。在28℃培养条件下,IPTG诱导表达重组抗体,提取周质蛋白。经SDS-PAGE和Western Blotting的方法鉴定,结果表明成功获得约28 kDa的LMG-scFv,且在表达过程中LMG-scFv被标记上生物素;LMG-Fab的蛋白电泳结果显示,在分子量约为27 kDa处有一明显条带,与Fab打开二硫键后的κ链大小相符。另外,表达出的LMG-scFab分子量约为54 kDa,大小与预期相符。(3)三种重组抗体的免疫分析特性比较研究通过间接竞争ELISA,以表达获得的三种重组抗体分别建立针对LMG的标准抑制曲线。采用LMG-scFv-Biotin时,对LMG的半抑制浓度IC50为20.11 ng/mL,线性检测范围在4.11~98.56 ng/mL之间;采用LMG-Fab时,IC50为45.56 ng/mL,线性检测范围为12.80~162.13 ng/mL;采用LMG-sc Fab是,对LMG的IC50为37.48 ng/mL,线性检测范围为10.28~136.68 ng/mL。同时,以LMG的类似物为药物,对三种重组抗体的特异性进行评价。结果表明,除了与隐性结晶紫交叉有交叉反应外,三种重组抗体对其它三苯甲烷类似物均没有明显交叉反应,说明三种抗体均保留了亲本单克隆抗体的特异性。此外,稳定性分析结果显示,三种重组抗体的稳定性依次为Fab>scFab>scFv。