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蚊虫是多种重要传染病的传播媒介,全球每年有上百万人因感染蚊媒病而死亡。由于目前尚无疫苗和有效的预防药物来防治登革热,因此,须通过控制媒介蚊虫的数量以阻断蚊媒病的爆发流行。苏云金杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelnsis,简称Bti)可有效用于蚊虫防治,但相较于化学杀虫剂,其杀蚊活性相对较低,生产成本相对较高等缺点阻碍了它的进一步推广应用。因此,如何提高Bti制剂的杀蚊活性并降低其生产成本成为了亟待解决的问题。迄今,对蚊虫抵御Bti侵染的分子机制尚不完全清楚,研究Bti和埃及伊蚊互作机制将有助于寻找提高Bti杀蚊活性的有效途径。基于以上思路,本研究从宿主对Bti侵染的应答机制和Bti的增效培养基原料两方面入手,一方面,以宿主为研究对象,采用荧光显微技术和转录组测序的方法揭示埃及伊蚊对Bti的抵御机制,定向发掘埃及伊蚊体内Bti胁迫下诱导的功能性基因,并利用壳聚糖纳米微球介导的RNAi技术研究其功能,为开发增加Bti杀蚊活性的增效剂提供有效的筛选靶标。另一方面,以Bti菌株LLP29为研究对象,利用富含几丁质、壳聚糖和木质纤维素的食用菌栽培废料作为增效碳源,研究其用于培养高效杀蚊Bti的潜力,提高Bti制剂的杀蚊活性和持效性,为降低Bti的生产成本,寻找提高Bti杀虫效果的有效途径及针对性地改造和开发廉价高效生物灭蚊剂提供科学依据。为了揭示蚊虫对Bti侵染的应答机制,本研究以登革热重要媒介埃及伊蚊(Aedes aegypti)和高效杀蚊Bti菌株LLP29为研究对象,利用下一代测序技术通过Illumina/Solexa高通量测序平台对应答过程的幼虫转录本进行测序分析。结果表明在侵染过程中有246个转录本的差异表达倍数在2以上,包括与免疫反应、细胞凋亡、解毒作用、受体竞争性结合蛋白、细胞增殖和围食膜几丁质合成代谢途径相关的基因。通过基因本体(gene ontology简称GO)和途径富集分析,选取3个与应答机制相关途径的关键节点基因进行RNAi功能验证,分别为昆虫凝集素基因galectin、促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like 和细胞凋亡蛋白酶基因caspase-18。结果表明,galectin和mapk-like沉默的幼虫对Bti毒素的敏感性显著提高,而caspase-18沉默的幼虫则表现出Bti抗性。从毒理和应答方面推断出埃及伊蚊幼虫与Bti的互作机制,为下一步寻找提高Bti杀虫效果的有效途径提供理论基础。在差异表达的转录本中,有36个与细胞解毒酶相关的基因发生了差异表达。因此,蚊虫对Bti的抗性可能与其体内的解毒机制有关。基于以上思路,本研究测定了 Bti胁迫下,埃及伊蚊体内各种酶活性的影响。结果表明,Bti侵染能显著增加埃及伊蚊体内淀粉酶(183.2%)、P450酶(177.5%)、Na+/K+-ATP酶(142.9 %)的活性,并降低其乙酰胆碱酯酶(91.4 %)、谷胱甘肽S-转移酶(88.6%)的活性,而对蛋白酶活性总量无显著影响。为下一步通过调控昆虫解毒酶活性来提高Bti杀虫活性,进而开发出更加高效的Bti制剂提供了理论基础。差异表达分析结果表明,埃及伊蚊幼虫可能通过对围食膜的快速修复来阻碍Bti的进一步侵染,防止Bti的侵染。由于Bti能够表达几丁质酶,且利用富含几丁质的培养原料发酵培养Bti,能够促进其几丁质酶的分泌,从而提高Bti产品的杀虫活性。基于以上思路,本研究利用富含几丁质和壳聚糖的菌糠作为主要碳源,探究其用于培养Bti的潜力。首先,分析了不同前处理方法对菌糠生物质转化效率的影响。结果表明:在2 %硫酸、121 ℃处理1h的条件下,其木质纤维素转化效率最高,还原糖的产量达到284.24 g/kg SMS,且芽孢产量也是最高。进而,利用菌糠浸提液(2 %硫酸,121 ℃, 1 h)作为主要碳源,通过单因素筛选、PB设计、最陡爬坡和响应面优化设计筛选出最佳的培养基配方:54%浸提液、31.9g/L 黄豆饼粉、0.88g/LCaCO3、0.4g/LMnSO4、0.5g/L K2HPO4和0.4 g/L吐温100。验证结果表明,优化后培养基产生的芽孢数是原始菌糠培养基的27倍。为了探讨利用菌糠通过固态发酵培养高效廉价的Bti杀蚊制剂的可行性,对菌糠的总碳、总有机碳、氨基氮等营养成分进行了分析。结果显示:作为一种廉价易得的农业废弃物,菌糠中碳源含量高而氮源含量相对较低,仅需通过补充适量的营养因子,就可以满足Bti生长所需的营养。根据上述分析结果,设计了含适量氮源和无机盐离子的四种培养基(T1-T4),对它们发酵后的毒力效价和芽孢产量等指标进行测定。进而选定最优培养基T4,对其固态发酵条件进行了优化,结果表明最适发酵条件为:温度32℃,初始pH 6.0,含水量50%,粒度比1:3,接种量2%。将菌株LLP29按照最适培养基以及生长条件搪瓷盘浅盘培养后粉碎,以5100 ITU/mg标准品对照测定,其效价达到1487 ITU/mg,高于市售的Bti可湿性粉剂。本研究不仅为菌糠的再利用提供了新的途径,而且可显著降低生物灭蚊剂的生产成本,具有一定的应用前景。