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第一节腺病毒介导的HIF-la基因对大鼠脑出血后下游靶基因的影响目的:观察缺氧诱导因子-la(hypoxia inducible factor-la,HIF-la)基因对大鼠脑出血后下游靶基因VEGF、EPO表达的影响.方法:建立大鼠自体血脑出血模型,随机将大鼠分为磷酸盐缓冲液组(PBS组)、单纯腺病毒干预组(Ad组)和含有缺氧诱导因子-la腺病毒干预组(Ad-HIF-1a组)。模型制做后分别将PBS、Ad、Ad-HIF-1a注射到模型鼠出血侧侧脑室,然后观察(1)注射后4h、l d、3 d、7 d RT-PCR法检侧HIF-1a、VEGF和EPO mRNA的表达。(2) 4h、l d、3 d、7 d免疫组化检测HIF-1a、VEGF、EPO蛋白的表达。(3) 3d免疫荧光定位检测HIF-1a/VEGF和HIF-1a/EPO。结果:(1)大鼠脑出血后血肿周围存在HIF-1a、VEGF及EPO的表达,三者均在脑出血后4h开始升高,第3天达到高峰,到第7天时低于第1天的水平。(2)各时间点Ad-HIF-la组与PBS组和Ad组相比HIF-1a、VEGF及EPO在基因和蛋白水平的表达均明显增强,差异具有显著性(p<0.05),PBS组和Ad组相比差异无显著性(p>0.05)。结论:1.大鼠自体血脑出血后血肿周围组织有HIF-la、VEGF、EPO蛋白表达,表明脑出血本身可以诱导上述蛋白表达。2.大鼠自体血脑出血后应用缺氧诱导因子-la基因干预,血肿周围HIF-la mRNA和HIF-la蛋白表达明显增加,并可持续一周左右。表明携带HIF-la基因能够有效上调大鼠脑出血血肿周围组织HIF-la蛋白的表达。3.大鼠自体血脑出血后应用缺氧诱导因子-la基因能够促进下游靶基因VEGF、EPO的表达明显增强。第二节腺病毒介导的HIF-la基因对大鼠脑出血后内源性NSCs增殖、分化及血管新生作用的影响目的:观察缺氧诱导因子-la (HIF-1a)基因对大鼠脑出血后内源性神经干细胞(NSCs)的存活增殖、迁移、分化和血管新生的影响并探讨其作用机制。方法:建立大鼠自体血脑出血模型,随机将大鼠分为假手术组(Sham组)、单纯腺病毒干预组(Ad组)和缺氧诱导因子-la干预组(Ad-HIF-1a组)。模型制做后分别将PBS、Ad、Ad-HIF-1a注射到模型鼠出血侧侧脑室。BrdU标记内源性NSCs的增殖与分化。(1)于脑出血注射治疗后1d、7d、14 d、2l d、28 d进行神经缺失功能评分并比较。(2)免疫组化法观察3组大鼠脑出血室管膜下区(SVZ) DCX的表达。(3)免疫荧光法计数再灌注不同时间点室管膜下区BrdU阳性细胞(3、7、14、21、28 d)和BrdU/DCX、BrdU/GFAP(28d)免疫荧光双标细胞。(4)免疫组化检测CD31因子以反映血管内皮表达和用免疫荧光检测CD31/Brdu来反映血管内皮增生的情况。结果:(1)Ad-HIF-1a组在第7、14、2l、28 d神经缺失功能评分优于Sham组和Ad组(P<0.01,P<O.05)。(2)DCX在脑出血出血同侧7天时表达明显增加,14天达高峰,以后逐渐减少。应用HIF-1a基因后各时间点DCX明显增加,Ad-HIF-1a组分别与Sham、Ad组比较差异有显著性(P<0.05)。(3)Ad-HIF-la组BrdU标记细胞数明显增加;新生细胞分化结果显示:Ad-HIF-la组BrdU/DCX、BrdU/GFAP,与其它组相比较差异有显著性(P<O.05)。(4)Ad-HIF-la组CD31阳性细胞数与其它两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:缺氧诱导因子-1a基因可促进脑出血后内源性NSCs的增殖、迁移与分化和促进新生血管的形成,从而有利于神经功能的恢复。第二部分腺病毒介导的缺氧诱导因子-1a基因转染神经干细胞的实验研究第一节胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定目的:探讨胚胎大鼠脑皮质神经干细胞分离培养和鉴定的方法和神经干细胞的基本生物学特性。方法:从孕14～16 d的SD大鼠胚胎脑皮质中分离神经干细胞进行体外无血清培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,用免疫荧光染色方法对细胞的特性进行鉴定。结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞具有连续传代和增殖能力,诱导分化后可获得NeuN、GFAP、MBP和GAP-43阳性的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和突触素。结论:采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能大鼠胚胎脑皮质神经干细胞。第二节腺病毒介导的缺氧诱导因子-1a基因转染神经干细胞的实验研究目的:观察携带缺氧诱导因子-la的腺病毒感染神经干细胞后HIF-la的表达以及对神经干细胞生物学特性的影响。方法:培养胎鼠脑皮层神经干细胞,利用携带绿色荧光蛋白(GFP)和HIF-la基因的重组腺病毒(Ad)转染NSCs,相差显微镜下观察NSCs的形态特征及在荧光显微镜下观察NSCs及其诱导分化后的细胞的GFP表达情况;RT-PCR检测HIF-la在NSCs中的表达;应用免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导分化后神经干细胞的特异性标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异核蛋白(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果:(1)重组腺病毒HIF-la转染NSCs后,外源性HIF-la基因及绿色荧光蛋白有持续稳定表达;(2) HIF-la转染的NSCs形态学与未转染的NSC无明显差异,HIF-la转染促进NSCs增殖;(3) HIF-la-NSCs诱导分化后可以检测到神经元标志物NeuN、胶质细胞标志物GFAP和少突胶质细胞标志物MBP明显表达,证实转染后的NSCs同样具有多向分化潜能。结论:(1)携带HIF-la基因的腺病毒在体外能成功地感染神经干细胞,并得至HIF-la的表达。(2)HIF-la-NSCs的生物学特性没有发生改变。第三部分大鼠脑出血后HIF-la基因修饰NSCs对NSCs存活、迁移以及血管新生作用的影响目的:观察脑出血后HIF-la基因修饰的NSCs移植对细胞存活、迁移以及血管新生的影响。方法:建立大鼠自体血脑出血模型,大鼠随机分为磷酸盐缓冲液组(PBS)、Ad修饰的NSCs(Ad-NSCs)组和Ad-HIF-la修饰NSCs(HIF-NSCs)组,分别给予PBS、Ad-NSCs和HIF-NSCs注射到模型鼠脑出血血肿周围脑实质,NSCs移植前3天行BrdU标记。于移植后2d、8 d、14 d、2ld、28d、35d、42d、49d、56d进行神经缺失功能评分。免疫荧光三标检测HIF-NSCs在体内HIF-la的表达,移植后8周BrdU免疫荧光染色计数大鼠双侧皮层移植的神经干细胞数。免疫荧光检测CD31和CD31/Brdu阳性细胞计数。结果:(1) HIF-NSCs组在第8d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d神经缺失功能评分优于PBS组和Ad-NSCs组差异有显著性(P<0.05),PBS组和Ad-NSCs组比较各时间点神经缺失功能评分差异无显著性(p>0.05)。(2)移植后的Ad-HIF-la-NSCs在体内仍然能够表达HIF-la、nestin and dcx。(3) HIF-NSCs组出血侧大鼠血肿周围神经干细胞数较PBS组和Ad-NSCs组明显增多(P<0.01),PBS组和Ad-NSCs组比较差异无显著性(p>0.05)。(4)移植Ad-HIF-la-NSCs可以促进NSCs向血肿周围迁移并最终分化为神经元(约29%)和星形胶质细胞(63%),HIF-NSCs组存活细胞分化神经元比例明显高于PBS组和Ad-NSCs组,差异有显著性(P<0.05),而PBS组和Ad-NSCs组比较差异无显著性(p>0.05)。(5) HIF-NSCs组CD31阳性细胞数与PBS组和Ad-NSCs组比较差异有显著性意义(P<0.01),HIF-NSCs组CD31/Brdu双标阳性细胞明显增多,与PBS组和Ad-NSCs组比较差异有显著性意义(P<0.01), PBS组和Ad-NSCs组比较差异无显著性(p>0.05)。结论:1.移植携带HIF-1α基因的NSCs在脑出血大鼠体内能够有效表达目的蛋白HIF-1α,并能表达神经干细胞标志物巢蛋白nestin、神经元早期标志物dcx,移植并不影响Ad-HIF-1α-NSCs的神经干细胞特点。2.在大鼠脑出血脑内移植携带HIF-1α基因的NSCs能够存活、增殖、迁移、分化,有利于神经功能恢复。3.移植携带HIF-1α基因的NSCs能够有效促进血肿周围血管新生,有利于血肿周围脑组织侧枝循环的恢复和神经功能的修复。