论文部分内容阅读
枣树是起源于我国的古老果树,目前是我国产量最高的干果类果树。近年来,我国枣树感病寄主呈现不断增加趋势,病原涉及9个真菌属和4个细菌属。枣树真菌病害已严重影响到枣果实的产量和品质。白藜芦醇是植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的一种植保素,对植物真菌性病害具有明显的拮抗作用。对人类而言,白藜芦醇具有抗肿痈、保护心血管、抗氧化等多种功能。利用植物基因工程的基木原理和技术,将白藜芦醇生物合成途径关键基因转入枣树,不仅有望提高枣树拈抗真菌病害能力,也有可能改良枣果实的保健品质。白藜芦醇代谢途径中限速步骤较多,单纯过量表达某一个关键酶虽然可能对白藜芦醇的含量产生一定的促进作用,但由于其它步骤的限制,白藜芦醇高水平积累非常困难。要想大幅度提高转基因植物中白藜芦醇的含量,有必要进行多个基因共转化的尝试。通过基因融合技术产生的融合蛋白因存在“邻近效应”而具有更高的催化活性,是多基因共转化的首选,将构建的融合基因遗传转化枣树,有望大幅度提高白藜芦醇在枣树中的积累。白藜芦醇是芪合酶(STS)的产物,不同植物中STS的催化效率差异很大。白藜芦醇生物合成途径中,为STS提供4-香豆酰辅酶A底物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)和STS所催化的反应为整个途径的限速步骤。本研究首先从不同植物中鉴定和筛选高活性STS,设计5种不同长度的连接肽(过渡氨基酸链,Linker),将4CL与鉴定获得的高活性STS进行基因融合,构建4CL-STS融合基因。通过原核表达系统,对融合酶进行催化活性鉴定和酶动力学分析,确定融合酶获得最强“邻近效应”的基因融合方式。将鉴定成功的高活性融合酶基因构建植物表达载体,遗传转化枣树,实现融合基因在枣树中的过表达,确定转基因枣树植株中白藜芦醇的积累水平井验证其对真菌性病害的拮抗能力。研究结果如下：1.通过overlap PCR技术从葡萄叶片基因组DNA中克隆得到葡萄STS基因,连同前期丁作中获得的虎杖S璐基因,进行了原核表达分析。诱导表达产物经过Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,均得到分子量约43 kDa的可溶性纯化蛋白。酶促产物分析结果表明,两种酶催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,虎杖STS催化效率(Kcat/Km)是葡萄STS的2.4倍。且从植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(Polyketide synthase, PKS)超家族催化活性位点和保守位点角度分析了造成上述两种酶活性产生差异可能存在的原因。2.设计5种不同长度的Linker:(GSG)1、(GSG)2、(GSG)3、 (GSG)4和(GSG)5,通过overlap PCR和大引物降落PCR技术将拟南芥4CL基因与虎杖STS基因进行融合,得到融合基因4CL-xa-STS (x=3,6,9,12,15,a代表氨基酸残基),将其插入到原核表达载体pET30a(+)·的BamH I和Xho Ⅰ酶切位点之间,构建N端携带His标签的融合酶重组表达载体pET30a-4CL-xa-STS。将pET30a-4CL-xa-STS转入大肠杆菌Rosetta,进行原核表达分析。表达产物经Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,得到分子量均约104 kDa的5种可溶性纯化融合蛋白。体外酶促产物分析结果表明,5种融合酶均表现出4CL与STS的双重活性,催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,除无Linker、直接融合的4CL-0a-STS活性极低外,随着Linker序列长度的增加,融合酶催化效率依次降低,4CL-3a-STS的催化效率最高。融合蛋白同源模型分析表明两个蛋白结构域之间没有氢键或盐桥等强极性相互作用,活性位点的物理距离可能是影响融合酶活性的唯一因素,较长Linker增加了活性位点问的距离,从而降低了融合酶的活性。3.将经过鉴定的4CL-3a-STS构建植物表达载体,通过根癌农杆菌介导遗传转化壶瓶枣,4CL-3a-STS融合基因在组成型启动子(CaMV35S启动子+Ω增强子)的驱动下,实现了在转基因枣树植株中的过表达。经抗生素筛选和分子鉴定后获得5株转基因阳性植株。PCR、PCR-Southern和Northern检测结果表明融合基因4CL-3a-STS成功整合到赢瓶枣核基因组中,并在转录水平表达。壶瓶枣转融合基因植株中白藜芦醇平均含量明显提高,为2.07μg/g鲜重,是转STS单基因枣树植株的4.6倍。抑菌活性测定表明转基因植株提取物对枣树常见真菌病害——枣黑斑病病原菌枣假尾孢(Isariopsis imdica)和枣黑疔病病原菌细交链孢菌(Alternaria alternate)有明显的抑制作用。