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大豆疫霉(Phytophthorasojae)在分类上属于卵菌,与真菌亲缘关系较远而与藻类更为接近。每年由其引起的病害给全球大豆生产带来约10-20亿美元的经济损失。因此,研究大豆疫霉的致病分子机理对研究其防控手段与策略尤为重要。PEG介导的原生质体转化技术是研究大豆疫霉致病分子机理的重要手段,外源基因整合到基因组中进行表达,导致内源同源基因的沉默。但是,大豆疫霉的稳定转化技术存在转化周期长、转化子沉默效率较低、沉默不够稳定的缺点,同时,外源基因整合到基因组中容易造成整合位点附近的其他基因功能受到影响。因此,优化疫霉菌的遗传转化方法是疫霉研究者始终关注的课题。在过去的十年中,RNA干扰(RNAi)已经成为抑制真核生物基因表达的广泛而有效的工具(Hannon,2002)。MicroRNA(miRNA)是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,在动植物中参与转录后的基因表达抑制或沉默。利用天然的microRNA骨架作为前体,融合人工设计的特异性的小干扰RNA片段,构成artificial microRNA(amiRNA),可用于调控目的基因的转录水平。该方法在拟南芥、水稻和衣藻等物种中都被成功应用,具有特异性强、效率高的特点。本研究以大豆疫霉PsGK5、PsCDC14、PsAVR1d、PsAVR3b、PsIMPA等为靶标基因,分别设计并构建了相应的amiRNA沉默载体,并对这些amiRNAs在大豆疫霉基因沉默上的效果进行了分析。以大豆疫霉天然miRNA基因miR1a为前体构建了靶标基因的amiRNA载体。根据artificial microRNA的设计原则,在靶标基因的5’端选取序列,能够避免二级结构的形成。选取的序列须符合ACG(N)18T的特征,即:5’端的三个碱基必须为ACG,3’端的碱基必须为T,中间的18个碱基可以为任意序列。因此,同一个靶标基因可以有若干种不同的序列选择。理论上,amiRNA的自由能越低,稳定性越差,越容易同RISC形成复合体,沉默效率也就越高。计算候选的靶标序列自由能,选取自由能最低的序列构建amiRNA载体。将选取的碱基序列ACG(N)18T输入程序amiRNA primer creator,设计4条引物,通过重叠PCR构建amiRNA。根据以上设计原则,我们构建了 pTOR::GK5ami-1、pTOR::GK5ami-2、pTOR::GK5ami1-2、pTOR::CDC14ami-1、pTOR::CDC14ami-2、pTOR::CDC14ami 1-2、pTOR::AVR3Rb ami 以及pTOR::AVR1d ami 8个amiRNA沉默载体,用以验证其沉默效率。pTOR::PsIMPA ami用于比较稳定沉默与amiRNA介导的基因沉默的沉默效率。AmiRNA介导大豆疫霉基因沉默的效率分析。通过PEG-CaCl2介导的转化技术将pTOR::GK5ami-1、pTOR::GK5ami-2、pTOR::GK5amil-2、pTOR::CDC14ami-1pTOR::CDC14ami-2、pTOR::CDC14ami 1-2、pTOR::AVR3B ami 以及 pTOR::AVR1d ami导入大豆疫霉的原生质体,每个amiRNA载体随机挑选出28个转化子进行沉默效率的验证以及沉默突变体的表型分析。我们发现,amiRNA介导的大豆疫霉基因沉默的沉默效率在40%-70%;并且,对于PaIMPA的研究发现沉默突变体的筛选效率要比传统的疫霉稳定转化高。通过对PsGK5、PsCDC14、PsAVR3b和PsAVR1d沉默突变体表型分析,发现上述基于amiRNA的沉默突变体表型与传统的稳定转化突变体的表型一致。