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背景:
复发是阻碍急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)患儿长期无病生存的主原因之一。AML经治疗后,在骨髓细胞形态学检查为完全缓解(complete remission,CR)时,体内仍残留有0~1010个白血病细胞,残留的白血病细胞是复发的根源。常规骨髓细胞形态学不能检测到患者体内残留的白血病细胞,即微小残留病(minimal residual disease,MRD)细胞。目前PCR和流式细胞术是检测MRD的主要手段。通过MRD检测可了解患儿对化疗的敏感性,并预测复发,为减少复发进行早期干预(如给予更强烈的化疗以及干细胞移植)提供依据。近年MRD的检测大多是以骨髓为标本,由于白血病的非均一分布、髓外浸润以及化疗后骨髓重建引起的造血细胞反应性增生等,有时会出现假阴性或假阳性的结果,而且MRD需要动态观察,反复多次的损伤性骨髓穿刺患儿不易接受。因此,一种新的、取材方便、依从性高的MRD监测方法需要我们去探讨、发现,并逐渐应用于临床中。目前国内外已有报道使用流式细胞术证实了外周血可以完全代替骨髓监测T-急性淋巴细胞白血病(T-acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)的MRD,但有关儿童AML是否可以使用外周血代替骨髓进行MRD监测、特别是用更为简便的外周血定性PCR监测MRD未见报道。
目的:
检验用外周血监测AML患儿MRD的可行性;化疗前骨髓涂片与骨髓液两种标本用于MRD检测对比;动态监测AML患儿化疗前后MRD的变化。
对象和方法:
研究对象为所有在2007年4月~2008年3月在中山一院(包括黄埔院区)及部分在广东省人民医院儿科住院诊治、 FAB形态学和免疫分型符合AML的患儿。治疗方案是广州2002化疗协作组的2005-AML方案。
标本收集:1.所有治疗前AML患者的骨髓涂片常温下保存。2.AML-非M3患者分别在治疗前、诱导15天、诱导治疗结束后血象回升时(约从诱导治疗起满3~4周,简称诱导28天)和巩固治疗结束后血象回升时(简称巩固结束)收集骨髓液和外周血各2ml置-70℃保存。3.AML-M3患者分别在治疗前、诱导28天和巩固结束收集骨髓液和外周血各2ml置-70℃保存,按治疗方案M3患者在诱导15天无需骨髓检查。
以甲基化的降钙素(Calcitonin,CT)基因作为检测AML MRD的目的基因。提取骨髓液、外周血、骨髓涂片细胞的DNA,用MS-PCR方法扩增甲基化的CT基因,产物用电泳的方法检测,为定性检测。
结果:
1.符合入选标准的患者18例(年龄在11个月-15岁),根据骨髓形态学的不同分为M3组(6例)及非M3组(12例:M2 3例,M4 1例,M5 8例);根据取材的不同分为骨髓液组,外周血组,骨髓涂片组,均是18例;根据BFM危险度分型,分为高危组(5例)及非高危组(13例);根据取标本时间不同分为治疗前组、诱导15天组和诱导28天组和巩固结束组。
2.18例中,6例M3患者均已完成巩固治疗,12例非M3患者中只有7例己完成巩固治疗,因此合共13例收集到巩固结束后的骨髓液和外周血标本。
3.在所有18例患者中,治疗前骨髓液组CT甲基化阳性14例,阳性率77.7%,外周血组阳性14例,阳性率77.7%,骨髓涂片组阳性11例,阳性率66.6%,三组阳性率无统计学差异;诱导28天骨髓液组CT甲基化阳性4例,阳性率22.2%,外周血组阳性3例,阳性率16.7%,阳性率无统计学差异。18例中13例(非M3 7例,M3 6例)完成巩固治疗,巩固结束后骨髓液组与外周血组CT甲基化阳性均有2例,阳性率均为15.4%,阳性率无统计学差异。另外,12例非M3组在诱导15天的CT甲基化检测,骨髓液组阳性11例,阳性率91.7%,外周血组阳性9例,阳性率75%,阳性率无统计学差异。
结论:
1.在治疗前、诱导15天、诱导28天和巩固结束分别用MS-PCR检测甲基化CT基因,骨髓组和外周血组的阳性率无统计学差别,提示外周血可能可以替代骨髓液用定性MS-PCR方法监测儿童AML的MRD。
2.治疗前骨髓涂片与骨髓液甲基化CT基因的阳性率差别无统计学意义,提示骨髓涂片可能可以替代骨髓液进行化疗前甲基化CT基因的检测。
3.本研究探索用定性MS-PCR扩增甲基化的CT基因来检测儿童AML MRD的方法,简单、快捷、费用较低。治疗前骨髓液MRD阳性率77.7%,可以覆盖大多数AML患儿。18例患儿诱导28天阳性率22.2%,18例中只有13例已完成巩固治疗,阳性率15.4%,符合治疗后微残留白血病细胞逐步下降的客观规律,有必要进一步完善后在临床工作中开展。
4.用定性MS-PCR检测甲基化CT的方法监测AML的MRD,灵敏度为10-3。
5.由于随访时间有限,且病例数少,有必要在以后的工作中大量增加例数,结合MRD的结果长期随访。