论文部分内容阅读
目的:通过制备抗IL-17抗体,研究抗IL-17抗体在骨质疏松症中的作用,以及观察能否缓解双膦酸盐在治疗骨质疏松中造成的各种副作用,特别是颌骨坏死症中的作用,从而为有效提高骨质疏松症患者的生活质量及种植牙的成功率提供理论依据。方法:1.构建IL-17原核表达系统,利用大肠杆菌BL21进行表达,经超声破碎,镍离子树脂纯化,并经SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况以及纯化后目的蛋白的纯度。通过免疫及杂交瘤融合筛选等技术制备抗IL-17单克隆抗体,并对其亲和力、特异性等方面特性进行鉴定。2.体外检测抗IL-17抗体对大鼠破骨细胞分化相关因子调控的影响,利用Realtime-PCR检测经IL-17刺激及抗IL-17抗体阻断后大鼠成骨细胞中RANKL、OPG、TNF-α、M-CSF、IL-1α 及 IL-6 基因的表达情况。3.体外检测抗IL-17抗体对大鼠破骨细胞功能的影响,利用Realtime-PCR、ELISA、Western-blot检测经IL-17刺激及抗IL-17抗体阻断后大鼠破骨细胞中cathepsinK、MMP9表达情况。4.大鼠经去势构建骨质疏松动物模型,并随机分为卵巢切除组(OVX组)、假手术组(sham组)、卵巢切除后抗IL-17抗体治疗组(OVX+IL-17mAb组)、卵巢切除后ALN组(OVX+ALN组)、卵巢切除后抗IL-17抗体+ ALN组(OVX+IL-17mAb+ALN组)。经药物干预后,分别从体重、血清学生化指标、骨密度、生物力学进行检测,所得数据经SPSS13.0进行统计学分析。5.采用唑来膦酸尾静脉注射,并拔除所有大鼠右侧上颌第一磨牙,人为制造BRONJ诱发因素构建大鼠颌骨损伤动物模型。随机分为ALN组、ALN+抗IL-17抗体组和对照组。经药物干预后,ELISA检测大鼠血清IL-17的含量,并统计分析具有坏死暴露颌骨的大鼠数目。6.从42位健康人群的外周血淋巴细胞的PBMC中提取总RNA、扩增抗体库的VH区,同时用通用引物扩增出抗体库的所有VL区,然后利用重叠PCR构建ScFv并连接进pCANTAB5E载体构建ScFv噬菌体抗体库,并进行多轮筛选,并将通过多轮筛选获得的阳性克隆进行原核表达,利用ELISA,westen-blot检测所表达抗体的特异性。结果:1.通过将IL-17目的基因构建到表达载体pET-32a中,构建了表达IL-17的原核表达系统,利用原核表达菌BL21进行诱导表达,经超声破碎,镍离子树脂纯化,SDS-PAGE鉴定纯化后目的蛋白的纯度可达到90%以上。2.IL-17抗原免疫小鼠后,通过细胞融合技术成功筛选出1株中和性抗体,命名为6H2,抗体亚类为IgG1,经测定该株抗体亲和力达到1.98E-10。3.大鼠成骨细胞经IL-17刺激后,能够显著提高RANKL、TNF-α、M-CSF、IL-6、IL-1αmRNA的表达水平,并显著降低OPGmRNA的表达;经抗IL-17抗体阻断后TNF-α、IL-6、IL-1α的水平均恢复到接近对照组水平。4.大鼠破骨细胞经IL-17刺激后,能够显著提高cathepsinK、MMP9的表达水平,经抗IL-17抗体阻断后cathepsinK、MMP9的水平均恢复到接近对照组水平。5.通过在骨质疏松大鼠体内注射IL-17中和抗体发现,抗IL-17抗体能够有效降低大鼠体内ALP水平,并且具有显著差异(p<0.05),其骨密度、骨生物力学水平均优于OVX组大鼠,并接近sham组。且与阿仑磷酸钠联用后具有一定的协同作用。6.通过IL-17中和性抗体干预,结果显示抗IL-17抗体干预组创口周围软组织红肿现象减轻,其坏死暴露骨数目与唑来膦酸组相比较具有统计学意义(p<0.05)。并且在抗IL-17抗体的干预后IL-17水平明显下降,其含量与ALN组相比较具有统计学意义(p<0.05)。结果提示IL-17参与了颌骨坏死的进程,通过抗体阻断IL-17的功能,能够有效缓解颌骨损伤。7.以人IL-17为靶抗原,通过构建大容量噬菌体抗体库并进行筛选,经间接ELISA、竞争ELISA筛选到一株中和性的抗体,clone65号能够特异性抑制IL-17R与IL-17的结合,并呈浓度依赖性,从而为后续实验提供了基础。结论:1.成功筛选出了一株具有效价高、敏度高、特异性强的抗大鼠IL-17中和性抗体6H2株;2.结果提示IL-17可能通过调节成骨细胞RANKL、OPG、TNF-α、M-CSF、IL-1α及IL-6的表达水平在体外直接或者间接来影响破骨细胞的分化成熟。3.IL-17通过上调cathepsinK、MMP9的表达量,从而增强破骨细胞降解骨基质的能力。4.通过在骨质疏松大鼠体内注射IL-17中和性抗体发现,抗IL-17抗体能够抑制骨质疏松症状,且与阿仑磷酸钠联用后具有一定的协同作用。5.通过IL-17中和性抗体干预,结果显示通过抗体阻断IL-17的功能,能够有效缓解颌骨损伤。6.从构建的噬菌体抗体库中,经间接ELISA、竞争ELISA筛选到一株中和性的抗体,clone65号能够特异性抑制IL-17R与IL-17的结合,并呈浓度依赖性。