论文部分内容阅读
目的:藤黄属植物一般生长在热带地区，以乔木和灌木居多。藤黄属植物以其普遍含有多种药理活性而著称。其药用成分藤黄自古以来就一直被广泛用于治疗炎症、肿物等疾病。藤黄包含很多成分，如藤黄酸、别藤黄酸、异藤黄酸、新藤黄酸等等，藤黄酸（Gambogic Acid，GA;C38H44O8;分子量628.75）正是藤黄主要的活性单体成分之一。藤黄酸具有抗肿瘤作用，可以在体内和体外抑制多种肿瘤的生长，并且可以使毒副作用最小化，从而减轻对免疫系统和造血系统的毒性，已被国家食品药品监督管理局批准进行临床试验。除此之外，藤黄酸还具有抗感染、抗氧化、抗病毒等多种作用。 糖尿病性视网膜病变，是由于糖尿病发展过程中长期高血糖引起的一种慢性微血管并发症，是糖尿病的一种常见的、极为严重的并发症。三分之一以上的糖尿病患者伴有视网膜病变。很多糖尿病患者因为视网膜病变而引起视力下降、甚至视力完全丧失，从而严重影响生活的质量。糖尿病性视网膜病变主要分为早期非增殖性视网膜病变和晚期增殖性视网膜病变两大阶段。其中增殖性视网膜病变的标志是视网膜血管新生，而新生血管系统的脆弱和渗漏会引起视网膜的一系列不可逆损伤，最终导致失明。在糖尿病引起的视网膜血管新生过程中，HIF-1α、VEGF、iNOS的产生起到重要的作用，而与其相关的信号通路包括p38MAPK和PI3K/AKT。因此，我们在本研究中对主要应答于缺氧条件的PI3K/AKT信号通路，及其引起的HIF-1α、VEGF的变化进行了研究。 我们希望能过通过研究证明藤黄酸对糖尿病性视网膜病变的治疗作用。本研究大体分为三部分:首先，我们通过STZ诱导建立小鼠糖尿病模型，进行体内研究，观察藤黄酸治疗是否能减轻糖尿病小鼠视网膜血管新生。并检测视网膜血管新生及血管生成相关细胞因子的表达情况。之后，我们还检测了糖尿病小鼠模型中HIF-1α的表达及PI3K/AKT信号通路的活化的改变。同时，为了进一步证实藤黄酸对糖尿病性视网膜病变血管新生的抑制作用，我们也进行了相应的体外研究。将高糖条件下培养的视网膜血管内皮细胞作为糖尿病性视网膜病变的体外模型，然后检测藤磺酸对视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和形成管腔能力的影响。同时也对HIF-1α/VEGF信号及PI3K/AKT信号通路的活化进行了研究。 方法:1、C57BL小鼠随机分成5组，分别为对照组、糖尿病组、及糖尿病加不同剂量藤黄酸治疗组;除对照组，其他组小鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型，然后治疗组分别给予高、中、低剂量藤磺酸治疗。2、HE染色检测小鼠视网膜的组织形态学变化。3、CD31免疫荧光染色检测视网膜血管的新生。4、免疫组织化学检测小鼠视网膜组织中VEGF-A及VEGF-R2的表达水平的改变。5、Western blot检测小鼠视网膜组织中VEGF-A、VEGF-R2、FGF2、HIF-1α、PI3K、AKT及p-PI3K、p-AKT的表达水平的变化。6、Real-time PCR检测小鼠视网膜组织中VEGF-A、VEGF-R2、FGF2和HIF-1α的表达水平的变化。7、高糖及高糖加药物处理RF/6A细胞。MTT实验检测视网膜血管内皮细胞的增殖能力的变化。8、划痕愈伤实验检测视网膜血管内皮细胞迁移能力的变化。9、小管形成实验检测视网膜血管内皮细胞形成血管能力的变化。10、视网膜血管内皮细胞中血管生成相关的VEGF-A和VEGF-R2的表达水平用Real-time PCR检测。11、视网膜血管内皮细胞中VEGF-A、VEGF-R2和HIF-1α的表达水平用Western blot检测。12、免疫荧光检测了视网膜血管内皮细胞中HIF-1α表达的改变。13、Western blot检测了藤黄酸对糖尿病性视网膜病变体外模型中PI3K/AKT信号通路活化的影响。 结果:1、藤黄酸能够降低糖尿病小鼠视网膜中血管新生相关因子VEGF-A及其受体VEGF-R2、FGF2的表达水平。2、糖尿病小鼠视网膜中HIF-1α表达水平升高;而经过藤黄酸治疗后，糖尿病引起的HIF-1α表达上升被抑制。3、PI3K/AKT信号通路在糖尿病小鼠视网膜中过度激活;而藤黄酸治疗能够抑制糖尿病引起的PI3K/AKT信号通路的过度活化。4、高糖条件下培养促进视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成;而藤黄酸处理后，高糖引起的细胞增殖、迁移和血管形成均被抑制。5、藤黄酸还能有效降低高糖引起血管内皮细胞中VEGF-A、VEGF-R2和HIF-1α的表达升高。6、藤黄酸可抑制高糖引起的视网膜血管内皮细胞中的PI3K/AKT信号通路的过度活化。 结论:1、藤黄酸对糖尿病性视网膜病变显示出很好的治疗效果。2、藤黄酸能够降低糖尿病引起的视网膜中HIF-1α的表达上升，并抑制糖尿病引起的视网膜中PI3K/AKT信号通路的过度活化，从而发挥治疗糖尿病性视网膜病变的作用。3、藤黄酸能够通过抑制PI3K/AKT信号通路而抑制高糖引起的视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成。