论文部分内容阅读
背景与目的： 帕金森病(parkinson disease，PD)是一种神经系统变性疾病,以黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元进行性变性死亡为主要病理特征。到目前为止，PD的发病机制尚未完全明了，小胶质细胞介导的氧化应激损伤在PD的发病过程中起到了重要的作用。小胶质细胞是氧自由基的一个重要来源，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶是小胶质细胞的一种重要的调质，是小胶质细胞源性活性氧类物质（reactme oxygen species，ROS）的原始来源和小胶质细胞内促发炎症信息的一个机制。p47phox是NADPH氧化酶的关键亚基，p47phox在小胶质细胞源性ROS的形成中发挥着重要作用。 Sirtuins家族是一组依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的去乙酰化酶，在哺乳类中表达 SIRT1到 SIRT7七种亚型，沉默信息调节因子3（silent information responsor type3，SIRT3）是唯一与人类老化相关的Sirtuins家族成员，是一个定位于线粒体基质内的蛋白，与线粒体的代谢密切相关。过度表达 SIRT3已经被证实可以提高细胞的呼吸作用和降低ROS的产出。 姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素,是姜黄的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎、清除自由基等广泛的药理作用，还能够调节和抑制小胶质细胞的表达和迁移。研究显示，姜黄素能够通过促进转录因子Nrf2(Nuclear factorerythroid2-related factor)的表达减少细胞内活性氧类物质的产生，从而延缓细胞的衰老或凋亡。SIRT3在对抗氧化应激中起重要作用，但是姜黄素能否通过SIRT3抑制P47phox表达减少小胶质细胞源性ROS从而参与PD的神经保护目前仍缺乏相关研究。 为此，本研究选择姜黄素治疗鱼藤酮诱导的慢性PD SD大鼠模型，观察SD大鼠行为学变化，ROS含量，SIRT3 mRNA、P47phox mRNA含量及SIRT3、P47phox的表达情况，探讨姜黄素对PD大鼠的保护作用及SIRT3所介导的具体机制，为临床治疗提供理论依据。 材料与方法： 清洁级雄性SD大鼠40只，按随机区组法分为溶剂对照组、姜黄素组、鱼藤酮组、治疗组，每组10只。采用颈背部皮下注射鱼藤酮28天制备慢性PD SD大鼠模型，并进行行为学评价及mNSS评分验证，模型制备成功后，再给予姜黄素灌胃治疗28天。 采用悬尾实验观察大鼠行为学变化，Western-blot法检测大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox的表达，RT-PCR检测大鼠脑黑质区 SIRT3 mRNA、P47phox mRNA含量，流式细胞仪检测大鼠脑黑质ROS含量。 结果： 1.悬尾实验：4组大鼠挣扎次数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠挣扎次数少于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组大鼠挣扎次数少于溶剂对照组、姜黄素组，多于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）；溶剂对照组与姜黄素组大鼠挣扎次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 2. Western-blot检测 SIRT3蛋白表达：4组大鼠脑黑质区SIRT3表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）；溶剂对照组与姜黄素组脑黑质区 SIRT3表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 3. Western-blot检测 P47phox蛋白表达：4组大鼠脑黑质区P47phox表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）；溶剂对照组与姜黄素组脑黑质区P47phox表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 4. RT-PCR检测SIRT3 mRNA含量：4组大鼠脑黑质区SIRT3 mRNA含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3 mRNA含量低于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组脑黑质区SIRT3 mRNA含量低于溶剂对照组、姜黄素组，高于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）；溶剂对照组与姜黄素组脑黑质区SIRT3 mRNA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 5. RT-PCR检测P47phox mRNA含量：4组大鼠脑黑质区P47phox mRNA含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区 P47phox mRNA含量高于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组脑黑质区P47phox mRNA含量高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）；溶剂对照组与姜黄素组脑黑质区P47phox mRNA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 6.流式细胞仪检测ROS含量：4组大鼠脑黑质区ROS含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠脑黑质区 ROS含量高于溶剂对照组、姜黄素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组大鼠脑黑质区 ROS含量高于溶剂对照组、姜黄素组，低于鱼藤酮组，差异有统计学意义（P＜0.05）。溶剂对照组与姜黄素组大鼠脑黑质区ROS含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 7. SIRT3蛋白表达和P47phox蛋白表达相关分析：溶剂对照组及姜黄素组SIRT3蛋白与P47phox蛋白之间不存在线性相关（P>0.05），鱼藤酮组及治疗组SIRT3蛋白与P47phox蛋白之间存在线性相关（P<0.05），且为负相关。 结论： 1.鱼藤酮具有明显的神经毒性，可以成功制备慢性PD大鼠模型。 2.慢性PD大鼠模型中SIRT3表达减少造成P47phox表达增多，ROS含量增多。 3.姜黄素可能通过诱导SIRT3表达，使P47phox表达下调，ROS含量减少，从而参与了PD的神经保护。