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[目 的]探讨内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞促进骨再生修复的作用及其分子机制。[方法]1、从大鼠股骨和胫骨采集骨髓,从骨髓中分离骨髓间充质干细胞(BMSCs)和内皮祖细胞(EPCs);体外培养镜下观察两种细胞形态;采用成脂分化和成骨分化诱导培养基诱导BMSCs分化。油红O染色和茜素红S染色检测BMSCs的分化能力,流式细胞仪和免疫荧光法分别检测BMSCs与EPCs表面分子标记;体外培养成管试验检测EPC细胞血管形成能力;RT-qPCR检测EPCs标记基因表达;Western blot检测成骨相关基因的表达水平。2、体外构建EPC+BMSC共培养体系;RT-qPCR和Western blot检测骨生成相关基因mRNA和蛋白的表达水平;茜素红染色检测BMSCs细胞钙化结节的形成;CCK-8检测BMSCs增殖活力;ALP活性检测试剂盒定量ALP活性;免疫组化检测ALP表达和分布;扫描电镜(SEM)观察BMSCs骨生成。3、以方法2中的共培养体系为对象,CCK-8实验检测EPC增殖活力;免疫荧光检测内皮细胞标志蛋白在EPC的表达;RT-qPCR和Westernblot分析内皮细胞相关基因mRNA的表达、Transwell检测EPC细胞的迁移能力;体外培养检测EPC血管形成能力。4、制备EPC和BMSC单培条件培养基上清(CM-S),用EPC-CM-S处理BMSC;用BMSC-CM-S处理EPC;用BMSC-CM-S处理后的EPC来源的EPC-CMS再处理BMSC;ELISA检测各单独培养组细胞和共培养体系中BMP2与VEGF的分泌水平;RT-qPCR和Western blot检测骨生成相关基因mRNA和蛋白的表达水平;免疫组化检测BMSC细爬片ALP水平;免疫荧光检测测BMSC细胞中成骨分化相关转录因子Runx2、Osterix(Osx)表达。5、培养并分离EPC-外泌体,透射电子显微镜观察外泌体的形态,Western blotting检测外泌体表面标志物表达;将EPC-外泌体与BMSCs细胞共培养,探究EPC外泌体体来源miR-212-3p通过Smad-7对BMSCs成骨分化的影响。CCK-8和Transwell分别检测BMSC细胞增殖活力和迁移能力;ALP试剂盒检测ALP活性,RT-qPCR和Westernblot分别检测成骨分化相关基因的表达;茜红素染色检测BMSC钙化结节形成;双荧光素酶报告基因验证miR-212-3p与Smad-7的靶向关系。6、lncRNA-seq芯片检测共培养体系EPCs细胞中差异表达的lncRNA;CCK-8实验检测EPC细胞的增殖活力;Transwell实验检测EPCs细胞的迁移能力;RT-qPCR和Western blot检测内皮细胞标志基因和蛋白的表达水平;体外成管实验检测EPC细胞血管形成能力。[结果]1、从大鼠骨髓中成功分离到EPCs和BMSCs的细胞。与单独培养BMSCs细胞相比,EPCs+BMSCs共培养体系显著促进BMSCs细胞的增殖活力、ALP活性、成骨相关基因表达水平、钙结节形成。与单独培养EPCs细胞相比,EPCs+BMSCs共培养体系显著促进EPCs细胞的增殖活力、迁移能力、内皮细胞标志蛋白的表达水平、体外成管能力。2、单独培养的EPCs不分泌VEGF-A和BMP-2,单独培养的BMSCs不分泌BMP-2,但分泌VEGF-A,共培养体系中的VEGF-A和BMP2均具高分泌。EPCs条件上清不能启动和促进BMSCs的成骨分化。BMSCs激活的EPCs细胞通过分泌BMP-2促进BMSCs的成骨分化。3、EPCs外泌体处理后的BMSCs细胞中miR-212-3p异常高表达,敲降miR-212-3p显著降低BMSCs的成骨分化水平;EPCs外泌体miR-212-3p通过下调SMAD7促进BMSCs细胞增殖、迁移、和成骨分化。4、lncRNAMALAT1、lncRNAMEG3、lncRNA-ATB、lncRNAHULC 在共培养体系的EPCs细胞中高表达,且lncRNAMALAT1的上调水平最高。敲降LncRNAMALAT1显著将低共培养体系EPCs细胞细胞的增殖、迁移、内皮细胞分化和成管能力。本研究表明,共培养体系显著促进了 EPCs细胞中lncRNA-MALAT1的表达上调,并通过降低miR-124-3p对SOX7的负调控作用而促进EPCs细胞的增殖、迁移、内皮细胞分化和血管形成。[结论]1、EPC与BMSC共培养能够显著促进骨再生过程中的成骨分化和血管内皮细胞分化。2、共培养体系中BMSC细胞分泌VEGF-A刺激和激活EPC细胞,激活后的EPC细胞分泌MBP2促进BMSC细胞的成骨分化;这是一种“BMSC-EPC-BMSC循环反馈”的调控模式。3、共培养体系中EPC与BMEC的交互作用或互相调控,主要通过两种方式:直接分泌关键细胞因子调控成骨或血管生成;一种细胞以胞外分泌囊泡的方式转移核酸类或蛋白类调控因子而影响另一种细胞的分化或生物学行为。4、miR-212-3p、Smad-7、LncRNAMALAT1、miR-124-3p 和 SOX7 可能是骨再生和血管形成过程中的潜在标志分子。