海参（Sea cucumber, holothurians）以其高营养价值并极具药用价值而成为重要的海洋经济动物。当海参受到一定的外界刺激时很容易发生自溶现象，给其保鲜、贮藏、运输和加工等环节带来诸多问题，并造成资源浪费和经济损失。体壁作为海参的主要可食部分，主要由胶原蛋白和酸性粘多糖组成。海参的自溶与其体内蛋白酶的作用密切相关。但是，目前对于海参自溶过程中能够引起胶原蛋白降解的蛋白酶的种类和性质了解甚少。本文以刺参（Stichopus japonicus）为研究对象，研究其体壁中胶原蛋白酶的存在情况，进一步实现胶原蛋白酶的高度纯化并对其性质进行深入分析，为阐明海参胶原蛋白的代谢机制和海参自溶机理等提供实验依据和理论参考。通过测定不同蛋白酶抑制剂对海参体壁粗酶液降解其胶原蛋白能力的抑制作用，发现金属蛋白酶抑制剂EDTA，EGTA和1,10-phenanthroline能够强烈抑制海参体壁粗酶液对胶原蛋白的降解，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和Benzamidine对胶原蛋白的降解有轻微的抑制作用，其它蛋白酶抑制剂无明显影响。因此，推测在海参体壁中存在着能够分解胶原蛋白的金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析、Q-Sepharose离子交换层析和Phenyl-Sepharose疏水层析等方法，首次从海参体壁中纯化得到一种金属蛋白酶（Metalloproteinase, MP）。SDS-PAGE和明胶酶谱结果显示MP的分子量约为45kDa，酶在弱碱性pH范围内（8.0⁹.0）表现出较高活性，最适温度在40⁴5°C之间。金属蛋白酶抑制剂可明显抑制其活性，其他蛋白酶抑制剂对MP活性则没有明显影响。质谱分析得到3个肽段共58个氨基酸残基，与假单胞菌碱性金属蛋白酶同源性较高（91.4%），证明纯化的目的蛋白是一种金属蛋白酶。Ca²⁺能够显著影响MP活性，表明它是一种Ca²⁺依赖性金属蛋白酶。MP不仅在37°C，甚至在4°C都可以有效降解海参胶原蛋白，推测其很可能是参与海参自溶过程中降解胶原蛋白的一种重要蛋白酶。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析、Q-Sepharose离子交换层析，从海参体壁中纯化到一种丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase, SP）。SP的分子量约为30kDa，SP的最适温度和最适pH分别为45°C和9.0。丝氨酸蛋白酶抑制剂Chymostatin, Pefabloc SC等可明显SP活性，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64也有一定的抑制作用，而其他类型抑制剂对其活性没有明显影响。该酶分解荧光底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA的活性最高，米氏常数Km和kcat值分别为5.507μmol/L和0.6s-1。SP对海参胶原蛋白同样具有较明显的分解作用，因此推测其可能也参与海参自溶过程中对胶原蛋白的降解。蛋白酶种类繁多，参与机体新陈代谢，在生物体生命活动中发挥着重要作用。本文以刺参为研究对象，首次建立了二种不同类型蛋白酶（MP和SP）的纯化方法，并对它们的酶学性质进行了详细的研究，本文研究结果为解析海参自溶机理提供了理论依据，对海参保鲜、加工，特别是海参保鲜剂的开发有潜在的应用价值。