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据统计,疟疾仍然是世界上危害最为严重的传染病之一。随着近年来WHO提出在全球范围内消除疟疾的宏伟目标,疟疾的防治策略也逐渐由治疗为主转为预防为主。作为疟疾的病原体,疟原虫在人体内的发育包括红内期和红外期。而红外期不但是疟原虫感染的始动阶段,而且也是导致间日疟原虫复发的重要时期。如果能有效地干预红外期疟原虫(EEFs, exo-erythrocytic forms)的发育,则不仅能在源头上阻断疟疾的感染,而且能防止疟疾复发,因此肝期是设计疟疾预防手段的理想时期。宿主细胞自噬是近年来发现非常重要的胞内固有免疫应答机制,然而其在红外期疟原虫发育中的作用和机制尚未见报道。因此,本课题首先利用子孢子与肝细胞体外培养平台,采用间接免疫荧光和激光共聚焦技术来观察子孢子入侵小鼠肝细胞株后自噬发生情况；然后,通过定量PCR和计数存活EEFs的方法观察分别加入自噬诱导剂或抑制剂后对红外期发育的影响。实验结果发现,子孢子感染能诱导较低水平的肝细胞自噬疟原虫,加入自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin, Rap)后则能促进感染肝细胞自噬的发生,并自噬其中的疟原虫,而加入自噬抑制剂3-MA则能明显抑制肝细胞对EEFs的自噬；有意思的是,诱导肝细胞自噬EEFs后不但不能清除疟原虫,反而能明显促进肝期疟原虫的发育。因此,本课题还对肝细胞自噬后肝期疟原虫存活以及促进其发育的具体分子机制进行了初步的探讨。这有利于我们揭示新的肝期疟原虫免疫逃避机制,还可为设计新的红外期干预措施和最终消除疟疾,提供重要的理论依据和手段。一、自噬促进肝期疟原虫发育1.P.y BY265-RFP子孢子和Hepa1-6细胞体外共培养平台的建立：通过使用德国Whatman公司的DE52对解剖后的P.y BY265-RFP子孢子进行过柱,这种方法能很好地去除杂质和绝大多数细菌,然后再与Hepa1-6细胞进行共培养,以达到48h内细胞状态良好、无细菌污染的状态,并且子孢子入侵活力不受影响。2.间接免疫荧光检测子孢子入侵Hepa1-6后自噬发生情况：P.y BY265-RFP子孢子与Hepa1-6孵育6h、12h和24h,采用间接免疫荧光的方法标记LC3,再用激光共聚焦观察是否发生自噬,并统计出发生自噬的具体比例。结果发现,子孢子感染后最早能在孵育后6h诱导肝细胞自噬,但在孵育后24h的自噬最为明显,自噬发生率在20-30%。3.自噬诱导剂和抑制剂对疟原虫红外期的影响：在自噬发生率较高的24h这个时间点,使用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin, Rap)诱导自噬,结果显示,诱导自噬能明显增加肝细胞自噬EEFs的比例,以及含EEF自噬体与溶酶体结合的比例。然而,使用自噬的PI3K类抑制剂3-MA后,肝细胞自噬EEFs比例及其与溶酶体结合的比例显著降低。4.体外观察肝细胞自噬对肝期疟原虫发育的影响：在P.yBY265子孢子和Hepa1-6共培养3h后,加入Rapamycin/3-MA后42h,收集细胞,采用定量RT-PCR检测疟原虫虫荷。结果提示,Rapamycin处理后能明显地促进EEFs的发育。反之,3-MA则能明显地抑制EEFs的发育。二、自噬促进疟原虫肝期发育及机制研究1. EEFs能在自噬体内存活并增殖为了证明诱导自噬能促进肝期疟原虫发育,我们对自噬体中EEFs的形态及增殖能力进行了观察。子孢子和Hepal-6细胞共培养3h换液后,在雷帕霉素作用下培养至24h。然后采用间接免疫荧光的方法对LC3进行标记,并且使用DAPI或者EdU,(一种可以被整合进入复制中DNA的胸腺嘧啶核苷类似物)观察疟原虫增殖情况。实验结果发现大多数(-70%)EEFs均处于分裂状态,这说明EEFs在自噬体中是存活的并处于增殖状态。通过EdU进一步检测增殖情况表明,和宿主肝细胞细胞核一样,EdU同样被整合进入了EEFs的细胞核,在被LC3包裹的自噬体中EEFs的核同样标记有EdU。因此,这些数据表明肝期疟原虫可以在自噬体中存活并分裂增殖。2. EEFs抑制自噬溶酶体的酸化被自噬的病原体大多数都会降解,而我们的结果却表明疟原虫能够存活其中,是否是因为包裹疟原虫的自噬溶酶体不具备降解能力?因此,为验证包裹疟原虫的自噬溶酶体的降解功能,通过间接免疫荧光和共聚焦技术检测溶酶体的酸化标记CathD与EEFs结合情况,以此判断疟原虫是否抑制了自噬溶酶体的酸化。结果显示：正常入侵情况下,约30%的子孢子被自噬溶酶体包裹,但未被Cath D标记包裹。而Rap诱导后,约80%的EEFs被自噬形成自噬溶酶体,但也未观察到与Cath D聚集的情况。说明自噬溶酶体中溶酶体的酸化可能受到抑制。本研究利用红色荧光子孢子和肝细胞共培养平台,采用间接免疫荧光技术证明了子孢子感染后Hepal-6对其发生自噬,加入自噬诱导剂Rap后则显著促进肝细胞自噬疟原虫,而加入自噬抑制剂3-MA明显抑制肝细胞自噬疟原虫。RT-PCR及计数存活疟原虫结果显示,诱导肝细胞自噬能明显促进肝期疟原虫的发育,其机制可能与疟原虫能抑制自噬溶酶体酸化密切相关。因此,本研究提示肝期疟原虫可利用肝细胞自噬促进自身发育,这可能是肝期疟原虫的一种新的免疫逃避机制,可为设计新的红外期干预措施提供新的靶点和思路。