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目的：
造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)是干细胞的一种,其主要功能是通过不断分化产生各系造血祖细胞,为血液系统提供新生细胞来源;同时又能自我更新维持自身数量不变,从而长期维持机体的正常造血机能,这种分化及我更新的能力是外周血干细胞移植(peripheralblood stem cell transplantation PBSCT)的生物学基础。PBSCT是治疗急性白血病和对化疗治疗敏感的实体瘤有效的方法,它是利用化疗和动员剂后外周血干细胞(peripheral blood stem cells,PBSC)-过性增高的机会进行采集、分离、低温冻存PBSC,将其复苏后回输给患者以重建造血功能。在PBSCT过程中,冻存技术及PBSC冻存后的归巢能力决定着PBSCT的成败。
HSC“归巢”是指HSC随血液循环最初出现在骨髓、脾、肝、甲状腺等多个器官,而后特异性地停留在骨髓干细胞龛。研究表明造血干细胞归巢的过程是多步骤粘附及迁移的过程,目前多认为P-、E-选择素,VLA-4及其配体血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),CD44,基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和其特异性受体CXCR4等在HSC归巢中起关键作用。细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平过高发生氧化应激,可导致归巢重要粘附分子P-selectin、VLA4、VLA5、CXCR4、CD44等表达异常,进而影响HSC的归巢能力,ROS是指细胞利用氧进行能量代谢的副产物,其主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。本实验通过检测经程控降温液氮保存前后PBSC的ROS水平及归巢分子的表达,分析二者之间的相关性,评价深低温冻存、复苏对外周血干细胞归巢能力的影响及原因,为进一步改善冷冻保存及复苏的条件,保护PBSC免于氧化应激损伤,维持其良好的生物学功能提供理论及实验依据。
方法：
一、采集、冷冻保存及复苏PBSC
外周血干细胞来自中国医科大学附属第一医院血液科血液系统肿瘤患者,患者经化疗及重组人粒细胞集落刺激因子(rHu-GCF)动员后应用COBESpectra(GambroBCT,JSA)血细胞分离机应用PBSC分离程序采集外周血1～2次,得到含有PBSC的血液,进行常规临床冻存时留取相关功能检测样本,经功能检测后废弃样本。将含有PBSC的血样在无菌室超净台内用Ficoll分离出PBSC后,分为实验组及对照组,实验组细胞中添加由自体血浆、ACD抗凝剂、二甲基亚砜(DMSO)按7:2:1比例组成的冷冻保护剂,置HBL-96型程序降温仪中进行降温,达到-86℃保持10min后,取出冷冻标本,迅速置入-196℃液氮罐中冻存1、3、6、9、12个月后,取出标本放入37℃水浴箱中快速复苏细胞。对照组细胞中不添加冷冻保护剂及经程控降温冷冻保存。
二、观察检测指标
分别观察检测复苏的实验组及对照组PBSC以下指标:用ABXMicros60血细胞计数仪进行细胞计数;0.4%台盼蓝溶液测定PBSC台盼蓝拒染率;37℃、5%CO2饱和湿度培养14天后在倒置显微镜下计数CFU-GM集落数;流式细胞术检测细胞内ROS水平;流式检测细胞表面抗原CD34、CD133以及归巢相关分子VLA4、CXCR4、CD44的表达;研究ROS水平与归巢分子的表达之间的相关性,评价冻存、复苏PBSC过程中ROS水平对HSC功能,特别是归巢功能相关粘附分子表达的影响。数据用均数±标准差表示,运用SPSS14.0统计软件分析数据,不同冻存时间的数据与冻存前数据比较时采用方差分析,分析ROS水平与归巢分子表达之间相关性时采用相关分析,P<0.05为差别具有统计学意义。
结果：
1.PBSC经液氮深低温保存后,台盼蓝拒染率随冻存时间延长逐渐降低,PBSC冻存1个月的台盼蓝拒染率与冻存前比较无显著性差异(P>0.05);冻存3、6、9、12个月与冻前比较具有统计学显著性差异(P<0.05);冷冻保存半年后台盼蓝拒染率降至80%-90%,一年后的台盼蓝拒染率为70%左右。
2.冷冻保存的PBSC体外生成CFU-GM的能力不及冷冻保存前的标本,并随冻存时间延长集落生成能力存在下降趋势,冻存1、3、6个月与冻存前比较无显著性差异(P>0.05),冻存9、12个月与冻前比较具有显著性差异(P<0.05)。
3.PBSC经液氮深低温保存后,干细胞表面标志性抗原CD34、CD133及归巢相关分子CD44、VLA4、CXCR4占淋巴细胞百分率随冻存时间的延长有所下降,冻存1、3、6、9个月与冻存前比较无显著差异(P>0.05),冷冻保存一年后与冻存前相比具有显著性差异(P<0.05)。
4.随着冷冻保存时间的延长,细胞内ROS水平逐渐升高,冻存1、3个月的外周血干细胞内ROS水平与冻存前比较无显著性差异(P>0.05),冻存6、9、12个月后细胞内ROS水平与冻前比具有显著性差异(P<0.05)。
5.PBSC内ROS水平与细胞CD34+VLA4+、CD34+CXCR4+、CD34+CD44+双阳性表达率之间的相关系数分别为-0.503、-0.457、-0.465(均P<0.05),ROS水平与归巢分子的表达均呈负相关。除此之外,ROS与台盼蓝拒染率呈负相关关系,相关系数为-0.863(P<0.05),细胞内ROS水平升高后导致细胞存活率降低。ROS与CFU-GM之间相关系数为-0.329(P>0.05),提示ROS与形成CFU-GM能力之间呈负相关关系,但相关关系并不密切。
结论：
1.外周血干细胞归巢粘附分子表达随冻存时间延长而逐渐下降。
2.冻存时间超过半年以上的外周血干细胞ROS明显增高,且随冻存时间延长而显著增加。
3.冻存的外周血干细胞ROS水平与其归巢粘附分子表达率成显著负相关。
4.ROS水平增高是外周血干细胞冻存复苏后归巢能力降低的原因之一。