论文部分内容阅读
实验目的对刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子(TgADF)基因进行生物信息学分析,并对该基因进行克隆、表达,表达产物纯化后分析其抗原性；观察重组弓形虫肌动蛋白解聚因子(rTgADF)免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答和抗弓形虫感染的能力,探讨rTgADF作为弓形虫候选疫苗的可能性。实验方法第一部分：对TgADF的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、SOPMA、 MotifScan、SWISS-MODEL, NCBI上的Bcepred等生物信息学在线分析程序,结合DNAMAN生物信息学软件,分析、预测TgADF蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性、跨膜区,翻译后修饰位点、亲(疏)水性、二级结构、抗原表位、三维模型等。第二部分：构建重组质粒pET30a (+)-TgADF,并在大肠杆菌中高效表达。对表达的rTgADF蛋白进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA；设计合成引物并引入BamH I和XhoⅠ酶切位点,RT-PCR扩增编码TgADF的基因片段克隆到原核表达质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆；重组质粒pET30a (+)-TgADF在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。大量表达rTgADF,以Ni-NTA层析法纯化蛋白,用His标签抗体及兔抗弓形虫血清做Western blotting分析。第三部分：观察不同剂量rTgADF滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答。BALB/c小鼠40只随机分为5组,免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μg rTgADF/只滴鼻免疫小鼠,免疫3次,分别于第0、14、21天各一次,rTgADF溶于PBS中,对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,颈椎脱臼处死小鼠,ELISA法检测肠液、鼻咽冲洗液及膀胱冲洗液的sIgA和血清IgG。分离培养脾淋巴细胞,CCK-8法测定其刺激指数并收集培养上清,ELISA法测定上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量。综合多项指标确定最佳免疫剂量。第四部分：观察30μg rTgADF滴鼻免疫小鼠诱导的免疫保护性。BALB/c小鼠60只随机分为2组,用30μg rTgADF溶于20μl PBS中免疫小鼠3次,分别于第0、14、21天各一次,对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,末次免疫后第14d,分别用1×104个速殖子(慢性感染,免疫组和对照组各8只)或4×104个速殖子(急性感染,免疫组和对照组各22只)/只灌胃攻击小鼠。30d后颈椎脱臼处死慢性感染后小鼠,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子,并观察记录急性感染小鼠健康状况及其存活情况。实验结果通过生物信息学分析,刚地弓形虫ADF有4个表面可及性参数≥1.9的区域、1个柔韧性参数得分≥2的区域、5个翻译后修饰位点、7个潜在抗原表位,可能具有免疫原性,成为弓形虫候选疫苗。以RH株弓形虫速殖子cDNA为摸板,扩增获得357bp的TgADF基因片段,并成功构建重组质粒pET30a (+)-TgADF; IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,结果表明目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,相对分子量(Mr)约20kDa。Western blotting显示,纯化后的rTgADF能被抗His标签抗体及兔抗弓形虫免疫血清识别。30、40μg组小肠、鼻咽及膀胱冲洗液sIgA含量显著高于对照组(F值分别为18.260、17.200；20.220、16.310；14.820、14.215,P<0.01),30μg组最高；30、40gg组血清IgG水平显著高于对照组(F值分别为22.270,24.103,P<0.01),40μg组最高。与对照组比较,rTgADF刺激后,30、40μg组SI均增高(F值分别为7.272、5.433,P<0.05),ConA刺激后SI增高无统计学意义。30、40μg组培养上清IFN-γ、IL-2含量与对照组比较均增高(F值分别为26.917、24.115；18.860、16.205,P<0.01),30μg组最高；20、30、40μg组的IL-4含量高于对照组(F值分别为6.252、7.328、7.115,P<0.05),组间差别无统计学意义；IL-10含量,与对照组相比并未增高。综合以上指标,确定30μg为较佳免疫剂量。1×104个弓形虫速殖子/只灌胃攻击后,免疫组小鼠肝内虫荷(13.89±1.2733×105/g)低于对照组(43.09±3.0332×105/g),P<0.01,减虫率为67.77%；免疫组小鼠脑内虫荷(6.33±0.4272×105/g)低于对照组(12.92±3.3030×105/g),P<0.05,减虫率为51.01%。4×104个速殖子/只灌胃攻击,小鼠出现竖毛、倦怠、活动及饮食减少等表现,30d后对照组小鼠无存活,免疫组小鼠存活4只。结论生物信息学分析可知,刚地弓形虫ADF存在7个潜在抗原表位,可能具有免疫原性。成功构建重组质粒pET30a(+)-TgADF,并在大肠杆菌中高效表达。30μg组rTgADF滴鼻免疫有效诱导了黏膜和系统免疫应答,并有效降低弓形虫感染小鼠肝、脑组织内虫荷。本研究结果表明,刚地弓形虫ADF具有免疫原性,诱导了较强的免疫应答并有效抵抗弓形虫感染,可能作为弓形虫疫苗的候选抗原。