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目的：采用组织工程人工骨修复大型骨缺损时，移植材料内部的供氧以及细胞新成代谢物质的及时循环运输一直是困扰研究人员的难题之一。为了初步解决这一难题，本课题组提出了组织工程人工骨早期血管化的策略，并且采用体外实验已经证实[1]：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外进行共培养时发现其形成脉管系统的效果较其余组更佳，提示HUVECs和BMSCs细胞在复合培养过程中具有相互促进增殖分化的作用，有望应用于体内大型骨缺损的修复，改善修复中脉管形成不足引起的坏死等问题。为进一步验证共培养体系在骨质缺损区作用效果本实验采用SD大鼠颅骨缺损模型，BMSCs与HUVECs复合骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架(HA-TCP)支架移植修复缺损，观察该骨缺损血管生成情况，探讨BMSCs与HUVECs复合HA-TCP支架共移植在体内后促进脉管生成的效果，为制备出能够实现初期脉管系统组织工程骨重建大型骨丧失提供初步实验基础。 方法：1、采用4周龄，体重为120～160g的SD大鼠颈椎离断处死后在无菌前提下分离取出双下肢胫骨和股骨，冲洗出骨髓，进行体外分离、培养BMSCs，并鉴定。常规复苏经购买所得的人脐静脉内皮细胞株，然后体外培养扩增。2、各组细胞经体外培养后采用血球计数板计数各组细胞数量，根据所得数据，制备3组细胞支架复合物分别为骨髓间充质干细胞-骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架复合物(BMSCs+HA-TCP)、人脐静脉内皮细胞-骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架复合物(HUVECs+HA-TCP)、骨髓间充质干细胞+人脐静脉内皮细胞-骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架复合物（BMSCs+HUVECs+HA-TCP）。分另培养一定时间于倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长贴附铺展状况。3、60只雌性SD大鼠(250-300g)完全随机分入A组、B组、C组和D组，每组分别有15只动物。在SD大鼠头骨正中线上建立10mm直径的头颅骨丧失模型，分别将空白HA-TCP支架和BMSCs+HUVECs+HA-TCP和HUVECs+HA-TCP和BMSCs+HA-TCP分别移植入A、B、C、D组大鼠颅骨缺损处并持续观察其颅骨处生长状况。实验分组：A组：移植采用相同培养基培养的空白HA-TCP支架;B组：移植BMSCs+HUVECs+HA-TCP复合物;C组：移植HUVECs+HA-TCP复合物;D组：移植BMSCs+HA-TCP复合物;4、观察指标：术后4、8、12周分别分析检测A组、B组、C组、D组大鼠标本，①Micro-CT观察大鼠颅骨缺损重建处骨质三维方向上的融合情况;②分别取出各组大鼠颅骨标本观察缺损处大体生长状况;③取出的样本后经过甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋、切片机切片后进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining)染色法染色以及CD31、CD34免疫组化染色观察颅骨缺损处移植支架中新生血管数量，并检测计算微血管密度（Microvessel density，MVD）以及CD34的累积光密度值(IOD)。④取出的标本进行酶联免疫吸附实验(Elisa)检查成血管相关的CD31、CD34分子，取出的标本进行蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测成血管相关的VEGF-A蛋白。 结果：1.成功分离培养鉴定骨髓间充质干细胞，并完成骨髓间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞与骨诱导磷酸钙生物陶瓷支架的复合培养。2.术后大体观察大鼠颅骨重建修复的生长状况B组较A、C、D组生长骨质更佳，并且B组观察颅骨处点状出血较多，说明形成血管较多。3.术后4、8、12周Micro-CT观察骨质新生量B组较其余三组多，间接反映B组新生血管较多或者两种细胞培养的作用。4.术后4周分析CD31免疫组化MVD值A组：21.8±1.30、B组：27.6±1.14、C组：26.0±1.22、D组：24.2±1.30。术后8周分析CD31免疫组化MVD值A组：25.8±1.79、B组：38.2±1.48、C组：32.4±2.30、D组：31.0±1.87。术后12周CD31免疫组化分析MVD值A组：28.2±1.64、B组：49.6±3.65、C组：37.0±2.12、D组：35.8±1.30。术后4周分析CD34免疫组化MVD值A组：20.6±2.07、B组：27.8±1.09、C组：25.4±0.55、D组：22.8±1.30。术后8周分析CD34免疫组化MVD值A组：24.0±2.74、B组：38.2±0.84、C组：32.0±1.00、D组：29.6±1.82。术后12周CD34免疫组化分析MVD值A组：28.8±0.84、B组：49.6±1.14、C组：36.8±1.30、D组：35.2±0.84。术后4周分析CD34免疫组化IOD(*103)值A组：34.77±9.62、B组：45.66±9.71、C组：33.30±10.19、D组：39.37±8.38。术后8周分析CD34免疫组化IOD（*103）值A组：34.96±12.90、B组：53.65±9.86、C组：45.60±9.77、D组：46.19±10.26。术后12周CD34免疫组化分析IOD（*103）值A组：42.18±9.91、B组：77.20±7.99、C组：66.45±6.44、D组：53.57±8.70。相对值显示B组＞C组＞D组＞A组，且随时间增加B组血管标记物较其他三组显著增加，C组较D组增加血管较快，具有显著差异（P＜0.05）。5.Elisa检测4、8、12周B组标本CD31分子相对含量分别为177.2±14.9、297.4±21.1、401.1±35.0结果均高于其余三组，具有显著差异(P＜0.05)。检测4、8、12周B组标本CD34分子相对含量分别为4.7±0.4、9.6±0.2、11.0±1.2结果逐渐增力且均高于同期A、C、D组，具有显著差异(P＜0.05)。6.Western Blot检测成血管相关的VEGF-A蛋白，VEGF-A蛋白灰度与β-actin内参灰度比值B组结果高于同期其余三组，4、8、12周比值分别为1.23±0.09、1.34±0.10、1.43±0.12，B组与A、C、D组具有显著差异(P＜0.05)。 结论：1.BMSCs与HUVECs能分别和共同在多孔的HA-TCP支架材料上正常粘附铺展增殖，并且无明显排斥反应。2.BMSCs与HUVECs共复合HA-TCP支架材料移植在大鼠颅骨大型缺损处，表现出最好的成血管的能力。